Фосфопротеинфосфатаза ядер селезенки быка: физико-химические свойства и механизм действия

• Автор: Резяпкин, Виктор Ильич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Ленинград
• Количество страниц: 151 c. : ил

г

Список сокращений БСА бычий сывороточный альбумин

Буфер А натрийацетатный буфер, 5,

ДСН додецилсульюат натрия

ДТНБ 5,5дитиобис2нитробензоат

ДТТ дитиотреитол

ДЭПК диэтилпирокарбонат

,Э 2иеркаптоэтанол

Нф нитрофенол

ПААГ полиакриламидный гель

пНФФ паранитрофенилфосфат

пЖБ парахлормеркурибензоат
РНаза рибонуклеаза
РФПФаза фосфорилированная форма ФПФазы
ТНБС тринитробензолсульфонат
Трис трисоксиметиламинометан
Фен фенилаланин
ФМСФ фенилметилсульфонилфторид
Фн неорганический фосфат
ФПФаза фосфопротеинфосфатаза
ФФН неорганический пирофосфат
ЭДТА динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
Ш этилмалеинимид
Кве глутатион окисленный
зн глутатион восстановленный
мг молекулярная масса
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ . II
2.1. Локализация ФПФаз . II
2.2. Субстратная специфичность ФПФаз . II
2.3. Множественные формы ФПФаз .
2.4. Субъединичная структура ФПФаз .
2.5. Углеводоодержащие кислые ФЛФазы .
2.6. ФПФазы клеточных ядер.
2.7. Классификация ФПФаз .
2.8. Термостабильные регуляторные белки ФПФаз. .
2.9. Роль пирофосфатсодернащих соединений, фторида и ионов двухвалентных металлов в регуляции активности ФПФаз.
2 Влияние гормонов на уровень ФПФазной активности
2 Регуляция ФПФаз глутатионон и полиаминами. . .
2 Механизм действия фосфатаз
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Выделение клеточных ядер из селезенки быка. . .
3.2. Экстракция из ядер и очистка ФПФазы
3.3. Определение активности и ФПФазы . .
3.4. Электрофоретическое разделение белков .
3.5. Идентификация ядерной ФПФазы методом двойных флуоресцирующих антител . . . .
3.6. Определение молекулярной массы ФПФазы .
3.6.1. Определение молекулярной массы ФПФазы методом гельхроматографии на сефадек
4
3.6.2. Определение молекулярной массы ФПФазы электрофорезом в ПААГ в нативных условиях .
3.7. Определение аминокислотного состава ФПФазы. .
3.8. Количественное определение свободных сульфгидрильных групп и дисульфидных мостиков
3.9. Изучение спектра поглощения ФПФазы в видимой области
3 Иммобилизация ФПФазы .
З.П. Изучение влияния температуры и на активность растворимой и иммобилизованной ФПФазы
3 Влияние ингибиторов на активность ФПФазы . .
3 Влияние модификаторов аминокислот на активность ФПФазы.
. Влияние модификаторов сульфгидрильных
групп на активность ФПФазы.
. Влияние ТНБС на активность ФПФазы . .
. Влияние ДЭПК на активность ФПФазы . .
3 Изучение трансфосфорилирования в присутствии ФПФазы.
3 0обмен в системе с ФПФазой
. Постановка опытов 0обмена.
. Выделение и очистка Фн и НФ для анализа на содержание 0
. Подготовка образцов Фц и НФ к массспектрометрическому анализу
. Анализ изотопного состава кислорода
в СО,
. Расчеты содержания в образцах . .
стр.
3 Выделение комплекса РФПФаза
3 Определение концентрации белка
3 Определение содержания углеводов в составе
ФПФазы
3 Статистическая обработка экспериментальных
данных
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
4.1. Выделение и очистка ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка
4.2. Субстратная специфичность и Кщ ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка
4.3. Молекулярная масса ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка
4.4. Химический состав и спектр поглощения ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка.
4.5. Иммобилизация ФПФазы из ядер селезенки быка и сравнительная характеристика иммобилизованной и растворимой форм фермента
4.6. Ингибиторы ФПФазы ядер селезенки быка
4.7. Влияние модификаторов аминокислотных остатков
на активность ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка.
4.8. Механизм действия ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка.
4.8.1. 0обмен в ходе гидролиза АДФ и пНФФ ФПФазой из ядер селезенки быка ЮЗ
4.8.2. Трансфосфорилирование в присутствии ядерной ФПФазы из селезенки быка.
4.8.3. Выделение фосфорилированного фермента после преинкубации ядерной ФПФазы с
рАТФ
меченым субстратом
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ НО
6. ВЫВОДЫ.
7. ЛИТЕРАТУРА
ВВЕДЕНИЕ


Исследование субстратной специфичности ядерной ФПФазы селезенки быка показало, что фермент катализирует дефосфорилирование казеина, АТФ, АДФ, пНФФ и практически не дефосфорилирует АМФ и 2глицерофосфат. В настоящей работе проведено исследование химического состава ядерной ФПФазы селезенки быка. Установлено, что ФПФаза является гликопротеином, который обладает дополнительным максимумом поглощения в области 5 нм. В составе фермента преобладают остатки кислых аминокислот над основными, содернатся два дисульфидных мостика и две сульфгидрильные группы. С помощью глютарового альдегида получена иммобилизованная на БСА форма ядерной ФАФазы. Сравнительное исследование иммобилизованной и растворимой ФПФазы показало, что обе формы фермента имеют сходные и температурный оптимумы, терыостабильность, при использовании в качестве субстрата пНФФ. Исследовано влияние ингибиторов молибдата аммония, фторида натрия, ФЛСФ, ДНК на активность ядерной ФПФазы селезенки быка. Ингибирование активности фермента молибдатом является конкурентным, а фторидом неконкурентным. Активность ФПФазы, обработанной фторидом, молибдатом и ФмСФ, полностью восстанавливается после удаления этих ингибиторов диализом. В данной работе с помощью различных модификаторов аминокислотных остатков установлено, что остатки лизина, гистидина и сульфгидрильные группы являются существенными для проявления ферментативной активности ФПФазы. Результаты Овключения из ГО в Фн в системе с этим ферментом указывают на то, что в процессе гидролиза фосфорных эфиров ФПФазой происходит отщепление фосфорильного остатка. С помощью АТФ показано формирование в процессе гид
ролиза в качестве промежуточного соединения фосфорилированного фермента. Полученные результаты позволили предложить схему механизма действия ядерной ФПФазы селезенки быка. ФПФазы широко распространены в различных тканях животных. Новикова 7, тсес2 клетках . Кроме того, ФПФазная активность обнаружена в различных клеточных структурах цитозоле 5, плазматической 9 и ядерной 9 мембранах, митохондриях , ядре 1, 2, ядрышке 7, хроматине . Таким образом, ФПФазы присутствуют во многих, если не во всех, тканях животных. Это обстоятельство свидетельствует о важной роли ФПФаз в регуляции фосфорилирования белков, а в конечном итоге в регуляции многих биологических процессов. ФПФазы катализируют дефосфорилирование различных фосфорилированных белков. Субстратами этих ферментов являются более двадцати энзимов, вовлеченных в метаболизм углеводов, липидов, аминокислот, белков, нуклеиновых кислот , ПО. ФПФазы дефосфорилируют белки цитоплазмы , мембран эритроцитов 1, ядерных мембран 9, негистоновые белки хроматина и гистоны 7, белки ядрышка 7, рибосом 0, фосвитин, казеин 2, фосфопептиды 2 и многие другие фосфопротеины. ФПФазы катализируют дефосфорилирование белков, фосфорили
рованных как по остатку серина и треонина , так и по остатку тирозина , . ФПФаза из печени и мышцы кролика, сердца быка катализирует детиофосфорилирование 3 тиофосфорилированной фосфорилазы 8. Скорость детиофосфорилирования составляет одну треть от скорости дефосфорилирования фосфорилазы. Кроме того, выделен белок Мг 0 Д, гомогенность которого показана электрофорезом в присутствии ДСН, одновременно обладающий ФПФазной и протеинкиназной активностями 2. Другая группа ФПФаз катализирует дефосфорилирование наряду с фосфопротеинами и низкомолекулярных фосфорных эфиров 2, 0, 1. ФПФазы являются, как правило, неспецифическими ферментами, способными дефосфорилнровать различные фосфопротеины . Целый ряд ФПФаз дефосфорилирует как основные, так и кислые фосфорилированные белки , . ИЗ. Гратекос и сотр. С другой стороны, ФПФаза из селезенки человека катализирует дефосфорилирование фосфоказеина и фосвитина и практически не дефосфорилирует гистоны, киназу фосфорилазы и гликогенсинтазу 2. Относительно высокой субстратной специфичностью обладает Сакальмодулинзависимая ФПФаза, которая в существенной степени дефосфорилирует только три из двадцати исследованных субстратов с. ФПФазы и легкую цепь миозина .