Структурно-функциональная и антигенная характеристика высококонсервативных фрагментов оболочечных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С

• Автор: Фарафонова, Татьяна Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 178 с. : ил.

Оглавление
1 Введение

2 Оболочечные белки вируса гепатита С и перспективы создания вакцины

2.1.Строение генома и организация вирусной частицы гепатита С

2.2.Экспериментальные модели для изучения вируса гепатита С

2.3.Молекулы на поверхности клеткихозяина предполагаемые рецепторы для вируса гепатита С.

2.3.1. Липопротеины низкой и очень низкой плотности и их рецепторы

2.3.2. 1 и в качестве рецепторов для вируса гепатита С

2.3.3. Асиалогликопротеиновый рецептор .

2.3.4. Лектины I и I

2.3.5. Гликозаминогликаны

2.4.Структура и функции оболочечных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С .
2.4.1. Общая характеристика структуры оболочечных белков.
2.4.2. Вариабельность оболочечных белков.
2.4.3. Структура и функции трансмембранных доменов оболочечных белков Е1 и Е2.
2.4.4. Образование дисульфидных связей и фолдинг оболочечных белков Е1 и Е
2.4.5. Влияние гликозилирования оболочечных белков на их структуру и функции.
2.4.6. Гетеродимер Е1Е
2.4.7. Образование вириона и высвобождение вирусной частицы во внеклеточное пространство.
2.4.8. Участки оболочечных белков, ответственные за распознавание возможных рецепторов вируса гепатита С.
2.4.9. Влияние оболочечных белков на регуляцию биосинтеза белков клеткихозяина
2.5.Антигенные свойства оболочечных белков вируса гепатита С.
2.6.Перспективы создания вакцины против вируса гепатита С
2.7.3аключение.
3 Материалы и методы.
3.1 Химические реагенты и биологические препараты
3.2 Растворители.
3.3 Оборудование и программное обеспечение.
3.4 Методы.
3.4.1 Синтез пептидов
3.4.1.1 Снятие защиты с концевой аминогруппы
3.4.1.2 Присоединение защищенных аминокислот к свободным аминогруппам на иглах
3.4.1.3 Ацетилирование Иконцевых ааминогрупп пептидов
3.4.1.4 Биотинилирование Кконцевых ааминогрупп пептидов
3.4.1.5 Снятие защит с боковых групп аминокислотных остатков пептида и снятие пептида в раствор пептидов с полимерного носителя
3.4.1.6 Восстановление сульфоксидных групп пептида.
3.4.2 Тестирование биотинилированных пептидов на взаимодействие с гепарином
3.4.3 Конъюгация пептидов с белкаминосителями.
3.4.3.1 Получение конъюгата пептида с белкомносителем с использованием глутарового альдегида.
3.4.3.2 Получение конъюгата пептида с белкомносителем с использованием
гидроксисукцинимидного эфира 3малеимидобензойной кислоты
3.4.3.3 Получение конъюгата пептида с белкомносителем с использованием диметилсуберимидата.
3.4.3.4 Получение конъюгата пептида с белкомносителем с использованием 1этилдиметиламинопропилкарбодиимид.
3.4.3.5 Качественная и количественная характеристика конъюгатов
3.4.4 Получение сывороток и препаратов иммуноглобулинов от иммунизированных животных.
3.4.5 Тестирование сывороток методом иммуноферментного анализа
3.4.5.1 ИФА с использованием в качестве антигена на поверхности планшета синтетических пептидов или конъюгатов пептидов
3.4.5.2 ИФА с использованием на поверхности планшета в качестве антигена синтетических биотинилированных пептидов
3.4.5.3 ИФА с использованием в качестве антигена пептида, ковалентно связанного с поверхностью планшет
3.4.5.4 ИФА с использованием в качестве антигена на поверхности планшета оболочечного белка Е2 и гетеродимера Е1Е2.
3.4.5.5 Конкурентный иммуноферментный анализ.
4 Результаты и их обсуждение.
4.1 Составление структурнофункциональной карты оболочечных белков
4.2 Поиск гликозаминогликансвязывающих участков в высококонсерватив
ных фрагментах оболочечных белков ВГС.
4.3 Изучение антигенных свойств высококонсервативных фрагментов оболо
чечных белков ВГС.
4.3.1 Выбор высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС для изучения антигенной активности и синтез соответствующих им пептидов
4.3.2 Получение синтетических конструкций, включающих ВКФ для иммунизации животных.
4.3.3 Получение антипептидных антител к фрагментам 3, 4, 5 и у кроликов.
4.3.4 Получение антипептидных антител к фрагментам I, 5 и у мышей
4.3.5 Определение специфичности антипептидных антител к препаратам оболочечных белков ВГС.
4.4 Получение синтетических пептидных В эпитопных конструкции на ос
нове высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС.
4.4.1. Синтез В эпитопных конструкций
4.4.2. Получение антител к ТВэпитопным конструкциям и определение их специфичности.
4.4.3. Взаимодействие анти ТВэпитопных антител с препаратами оболочечных белков ВГС.
4.5 Заключение.
5 Выводы.
6 Список литературы
7 Приложение.
1 Введение
Актуальность


Вирус, определенный таким образом как основной этиологический агент ниА ниВ гепатита, был назван вирусом гепатита С, а год стал датой его открытия. Идентификация ВГС с помощью молекулярного клонирования была первым шагом в изучении вируса. Изначально не были известны ни генетическая организация вируса, ни вирусные белки, транслируемые с генома ВГС, ни детали репликации. Несмотря на то, что вирусы гепатитов Л и В ВГА и ВГВ так же, как и ВГС, инфицируют клетки паренхимы печени и реплицируются в них, сходства между этими вирусами не было обнаружено. Было выявлено значительное генетическое и биологическое сходство ВГС с вирусами из семейства vivii, на основании чего ВГС был включен в это семейство в виде отдельного рода ivi . В это же семейство впоследствии был включен родственный ВГС вирус гепатита приматов. В состав данного семейства входят также род vivi представители вирусы клещевого и японского энцефалитов, лихорадок желтой, денге, Западного Нила и ivi представители вирусы диареи крупного рогатого скота, свиной холеры. Члены семейства vivii являются одними из самых мелких вирусов, имеющих бислойную липидную мембрану. Их геном представлен одной молекулой РНК положительной полярности с одной открытой рамкой трансляции ОРТ. В процессе репликации под действием вирусной РНКзависимой РНКполимеразы с не синтезируется РНК отрицательной полярности, которая служит шаблоном для синтеза копий РНК положительной полярности. Геномная РНК транслируется в полипротеинпредшественник, который ко и посттрансляционно расщепляется на несколько отдельных молекул белков. Часть этих белков входит в состав образующейся вирусной частицы, а остальные участвуют в процессах репликации, формировании репликативного комплекса и воздействии на клеткухозяина. РНКзависимая РНКполимераза, и их локализация в похожих позициях полипротеинов вирусов V , . Наличие протяженного высокоупорядоченного нетранслируемого района на 5конце генома, содержащего ряд неработающих инициирующих кодонов, сходно с морфологическими особенностями 5конца геномов пикорнавирусов и некоторых вирусов растений, таких, как потивирусы ii . ВГС циркулирует в инфицированном организме в различных формах. В плазме крови вирионы связываются с липопротеинами низкой и очень низкой плотности эта форма ВГС, повидимому, является самой инфекционной и с иммуноглобулинами детектируются и вирионы в свободном состоянии . Кроме того, недавно в плазме были обнаружены вирусные частицы, проявляющие физикохимические, морфологические и антигенные свойства нуклеокапсидов ВГС, не покрытых оболочкой . Изза низкой концентрации вирусных частиц в сыворотке крови больных и отсутствия эффективной системы культивирования ВГС в клетках вирионы ВГС еще не удавалось визуализировать с помощью электронной микроскопии. По этой причине отсутствует информация о трехмерной структуре вириона. Было показано, что высокоочищенные частицы ВГС имеют выдающиеся над поверхностью липидной мембраны стержнеобразные выступы размером нм i . Е1 и Е2. Внутри липопротеиновой оболочки находится нуклеокапсид, предположительно икосаэдри1ческой симметрии, диаметром нм, состоящий из множества копий корбелка и содержащий геномную РНК вируса i . Геномная РНК ВГС состоит из примерно нуклеотидов единственная ОРТ кодирует полипротеин, содержащий аминокислотных остатков и расщепляемый по крайней мере на белков три структурных корбелок и два оболочечных гликопротеина, Е1 и Е2 и 6 неструктурных белков 2, 3, 4, 4, 5, 5, а также белок р7, который не относят ни к тем ни к другим . С 5 и 3 концов ОРТ ограничивается нетранслируемыми участками НТУ длиной 1 и приблизительно 0 нуклеотидов, соответственно. НТУ 5 является крайне консервативным регионом, в составе которого содержится участок нуклеотиды 4, известный как внутренний сайт связывания рибосом i iii i, I. I непосредственно связывается с рибосомами для начала трансляции вирусной РНК и синтеза белковых компонентов вируса. Приблизительно первых нуклеотидов генома ВГС не участвуют в процессе трансляции по аналогии с другими вирусами, имеющими РНК положительной полярности, можно полагать, что они необходимы для репликации вируса.