Полифосфаты и экзополифосфатазы митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Пестов, Николай Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 116 с. : ил.

1.1. Ферменты, вовлекающие неорганические полифосфаты в превращение нуклеозидфосфатов.

1.1.1. Полифосфаткиназа полифосфат фосфотрансфераза, КФ 2.7.4.1.

1.1.2. ПолифосфатАМРфосфотрансфераза.

1.1.3. Участие неорганических полифосфатов в фосфорилировании 1.2. Реакции трансфосфорилирования, в которых неорганические полифосфаты

заменяют АТР.

1.2.1. Участие неорганических полифосфатов в фосфорилировании глюкозы

и других сахаров.

1.2.2. 1,3дифосфоглицерат полифосфатфосфотрансфераза КФ 2.7.4

1.2.3. Участие неорганических полифосфатов в фосфорилировании белков.

1.3. Запасание энергии неорганических полифосфатов в виде ДрН.

Глава 2. Неорганические полифосфаты в энергетическом метаболизме эукариот. Глава 3. Неорганические полифосфаты в митохондриях дрожжей.
Часть 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Объекты исследования.
2.2. Состав среды и условия культивирования.
2.3. Получение сферопластов из дрожжевых клеток.
2.4. Условия гиперкомпенсации.
2.5. Получение фракции цитозоля.
2.6. Выделение митохондрий.
2.7. Очистка препарата митохондрий.
2.8. Определение поглощения кислорода митохондриями дрожжей
vii.
2.9. Получение растворимой фракции митохондрий и фракции
митохондриальных мембран.
2 Получение фракций содержимого межмембранного пространства митохондрий и митопластов.
2 Определение полифосфаткиназой активности в изолированных митохондриях vii.
2 Инкубация изолированных митохондрий vii
2 Определение молекулярных масс экзополифосфатаз.
2 Экстракция неорганических полифосфатов.
2 Осаждение неорганических полифосфатов в виде нерастворимых солей бария.
2 Хроматография неорганических полифосфатов на бумаге.
2 Электрофорез неорганических полифосфатов в ПААТ.
2 Очистка неорганических полифосфатов от примесей ортофосфата
и пирофосфата
2 Определение ферментативных активностей.
2 Аналитические методы.
. Определение ортофосфата.
. Определение пирофосфата.
. Определение белка.
. Определение глюкозы.
Часть 3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1. Обнаружение неорганических полифосфатов в препарате изолированных
м итохондрий vii.
3.2. Экзополифосфатаза растворимой фракции митохондрий
vii в условиях гиперкомпенсации.
3.3. Сравнение влияния недостатка и избытка i в среде на содержание неорганических полифосфатов в сферопластах и митохондриях
vii.
3.3.1. Влияние недостатка и избытка i в среде на содержание неорганических
полифосфатов в сферо пластах vii.
3.3.2. Влияние недостатка и избытка i в среде на содержание и длину цепи неорганических иолифосфатов в митохондриях vii.
3.3.3. Влияние недостатка и избытка i в среде на активность экзополифосфатаз митохондрий vii.
3.4. Определение локализации неорганических полифосфатов в митохондриях
vii.
3.5. Определение полифосфаткиназной активности в изолированных
митохондриях vii.
3.6. Действие ингибиторов энергетического обмена на накопление неорганических
полифосфатов в митохондриях и сферопластах, а также на активности экзополифосфатаз митохондрий vii.
3.7. Влияние источника углерода на содержание и длину цепи неорганических
полифосфатов, а также на активность экзополифосфатаз митохондрий vii.
3.8. Влияние инактивации генаx, кодирующего экзополифосфатазу и гена,
кодирующего эндополифосфатазу, на обмен неорганических полифосфатов в митохондриях vii.
3.8.1. Инактивация гена эндополифосфатазы приводит к неспособности клеток vii использовать несбраживаемые субстраты.
3.8.2. Влияние инактивации генов x и на активность экзополифосфатаз митохондрий vii.
3.8.3. Растворимая экзополифосфатаза митохондрий vii кодируется геном x.
3.8.4. Влияние инактивации теш на содержание и длину цепи
неорганических полифосфатов в митохондриях vii. Заключение Выводы
Список литературы


Присутствие полиР в митохондриях дрожжей было показано лишь в одной работе с помощью метода 3,РЯМР vi . В митохондриях дрожжей vii были обнаружены растворимая и мембраносвязанная экзополифосфатазы, катализирующие отщепление Р, от конца цепи полиР и различающиеся по ряду физикохимических свойств i i. Это говорит в пользу участия митохондрий в метаболизме данных соединений. Актуальность изучения обмена полиР в митохондриях дрожжей определяется важностью понимания функций этих биополимеров как в митохондриях, так и в эукариотической клетке в целом. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение влияния условий культивирования и мутаций по важнейшим генам полифосфатного метаболизма на обмен полиР в митохондриях дрожжей vii. Провести обнаружение полиР в митохондриях дрожжей . Р, а также на активность экзополифосфатаз в митохондриях. Изучить влияние ингибиторов энергетического обмена на накопление полиР в митохондриях дрожжей . Сравнить содержание полиР в митохондриях при выращивании дрожжей . Определить влияние мутаций по генам полифосфатного обмена гена ррх кодирующего кДа экзополифосфатазу и гена ррп кодирующего эндополифосфатазу, на содержание полифосфатов и активность экзополифосфатаз в митохондриях. Определить влияние вышеуказанных мутаций на функциональное состояние митохондрий. Научная новизна работы. В работе впервые было показано, что содержание полиР в митохондриях дрожжей в значительной степени зависит как от концентрации фосфата в среде культивирования, так и от источника углерода. У дрожжей, выращенных на лактате, содержание полиР в митохондриях было значительно ниже, чем в случае использования в качестве источника углерода глюкозы. Показано, что для митохондрий, также как и для целых клеток, характерно явление гиперкомпенсации повышенного накопления полиР при переносе дрожжей с фосфатлимитированной среды на полноценную по фосфату среду. Показано, что в условиях гиперкомпенсации кислоторастворимые полиР митохондрий отличаются от кислоторастворимых полиР сферопластов по средней длине цепи и чувствительности к действию некоторых ингибиторов. Процесс накопления полиР в митохондриях в отличие от такового в сферопластах не подавляется 2дезокси0глюкозой, но в большей степени блокируется нигерицином. Полученные данные по действию разобщителей и ионофоров на накопление полиР в митохондриях дрожжей сегеутае, говорят в пользу того, что этот процесс зависит от электрохимического потенциала. Установлено, что растворимая форма экзополифосфатазы митохондрий дрожжей 5. Показано, что инактивация гена ррп1, который кодирует эндополифосфатазу, приводит к существенным изменениям в метаболизме полиР в митохондриях дрожжей и нарушениям функционального состояния этих органелл, что влечет за собой неспособность клеток использовать несбраживасмые источники углерода. Научнопрактическое значение. Разработана методика изучения эффекта гиперкомпенсации полиР с использованием сферопластов вместо клеток, что позволяет свести к минимуму гидролиз полиР, который происходит в ходе получения сферопластов при выделении органелл и улучшить возможности для исследования метаболизма полиР в отдельных клеточных органелл ах. Апробация работы. Результаты работы были доложены на ряде конференций на 6ой и 8ой конференции молодых ученых Биология наука го века Пущино, , , на 3ем съезде Российского биохимического общества СанктПетербург, . Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Автор приносит искреннюю благодарность своим . РАН Игорю Степановичу Кулаеву, д. Татьяне Валентиновне Кулаковской за постоянное внимание к работе и обсуждение ее результатов. Автор благодарит к. Л.П. Личко, к. Андрееву, старшего лаборанта Н. Н. Косенкову, старшего лаборанта Е В. Михайлину за оказанную помощь в работе, к. А.Г. Мсденцсва за помощь при измерении поглощения кислорода митохондриями дрожжей, лабораторию А. Корнберга Стенфордский университет, США за предоставление мутантных по генам полиР обмена штаммов . РАН за содействие при выполнении работы и активное обсуждение результатов.