Фосфорилирование регуляторных белков при сокращении гладких мышц

• Автор: Крымский, Михаил Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Регуляция сокращения гладких мышц.

2. Фазные и тонические гладкие мышцы

3. Тоническое сокращение гладких мышц.

4. Молекулярные механизмы регуляции Са чувствительности гладкомышечного сокращения

4.1 Са2зависимость фосфорилирования легких цепей миозина.

а Фосфорилирование и модуляция активности

б Модуляция активности фосфатазы
в Влияние на сокращение гладких мышц
г Фосфорилирование Са2независимыми киназами.
4.2 Зависимость силы сокращения от фосфорилирования .
а Регуляция нефосфорилированных актомиозиновых мостиков.
б Роль кальдесмона в регуляции Са2 чувствительности сокращения.
в Снижение зависимости силы сокращения от фосфорилирования
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .
1. Материалы
2. Методы.
2.1 Биохимические и физикохимические методы
Определение концентрации белков
Приготовление образцов тканей для электрофореза
Выделение тканевого
Электрофорез и денситометрия.
Иммуноблоттинг.
Изоэлсктрическое фокусирование.
Фосфорилирование белков i vi.
Фосфоаминокислотный анализ РАА.
Двумерные фосфопептидные карты 2
Выделение фосфопептидов
2.2 Иммунологические методы.
Получение фосфоспецифичных антител.
2.3 Молекулярнобиологические методы
Трансформация .i.
Бактериальная экспрессия.
Очистка рекомбинантного
2.4 Физиологические методы
Измерение сократительной активности мышц.
Нагрузка ткани РР и фосфорилирование i i.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Различия в сокращении тонических и фазных гладких мышц под воздействием форболового эфира.
2. Относительное содержание киназы легких цепей миозина, и кальдесмона в экстрактах тонических и фазных гладких мышц.
3. Фосфорилирование белков в гладких мышцах под воздействием форболового
4. Определение участков фосфорилирования , и кальдесмона
4.1 Определение сайтов фосфорилирования кальдесмона i viv
4.2 В ткани фосфорилируется по нескольким остаткам в короткой концевой области
4.3 Картирование участков фосфорилирования киназы легких цепей миозина
4.4 Фосфорилирование в гладкомышечных тканях происходит в
основном по домену
5. Получение фосфоспецифичных антител к и
6. Фосфорилирование , по участкам РКА и МАРК в тонических гладких мышцах под воздействием форболового эфира.
7. Фосфорилирование кальдесмона по сайтам киназы в тонических гладких мышцах под воздействием форболового эфира и форсколина
8. Фосфорилирование снижает силу сокращения скинированной фазной мышцы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Эти наблюдения позволяют предположить, что в гладкой мышце существуют дополнительные механизмы, регулирующие чувствительность этой ткани к i. Изменяя Са2чувствительность сократительного аппарата, гладкая мышца как бы симулирует изменения внутриклеточной концентрации свободного 2i при ее фаюическом постоянстве. Предполагается, что это свойство гладкой мышцы играет важную роль в т. В физиологических экспериментах установлено, что процесс сокращения глалкой мышцы сопровождается фосфорилированием рада сократительных и регуляторных белков. Са2кальмодулинзависимым ферментом киназой легких цепей миозина, в результате чего активируется АТФаза актомиозина и развивается сокращение. Помимо миозина, при сокращении фосфорилирутотся и другие регуляторные белки сама киназа легких цепей миозина, белок , являющийся независимо экспрессируемым Сконцевым фрагментом киназы легких цепей миозина, и белок кальдесмон. Однако остается неясным, вносит ли вклад такое фосфорилирование в изменение чувствительности гладких мышц к xi, какие внутриклеточные каскады и протеин киназы вовлечены при этом в фосфорилирование i viv, и как фосфорилирование влияет на активность этих белков. В настоящей работе исследовано фосфорилирование киназы легких цепей миозина, и кальдесмона при сокращении гладких мышц в ответ на форболовый эфир, наиболее сильный модулятор Сахчувствительности, определены участки и продемонстрированы вероятные эффекты фосфорилирования этих белков i viv. Целью настоящей работы являлось изучение роли фосфорилирования регуляторных белков в сокращении гладких мышц. Исследовать сокращение гладких мышц под воздействием форболового эфира и эндогенное фосфорилирование киназы легких цепей миозина, и кальдесмона. Определить участки фосфорилирования этих белков в гладкомышечной ткани. Изучить влияние фосфорилирования регуляторных белков на их свойства в модельных сократительных системах. Регуляция сокращения гладких мышц. У человека и высших животных существует три вида мышц скелетные мускулы, сердечные сердце и гладкие внутренние органы. Гладкомышечные клетки входят в состав сосудов, желудочнокишечного тракта, воздухоносных путей, мочеполовой системы и других органов, осуществляющих большинство физиологических реакций организма. Ионы Са2 играют ключевую роль в инициации сокращения как поперечнонолосагых скелегные и сердечные, так и гладких мышц . Увеличение концентрации внутриклеточного Са2 происходит при деполяризации клеточной мембраны или при связывании агониста с рецептором и последующей активации фосфолипазы С , приводящей к образованию инозитолтрифосфата i. Са в цитоплазму, а 1Рз вызывает высвобождение Са1 из саркоплазматического ретикулума i . В гладкой мускулатуре существуют две основные регуляторные системы, обеспечивающие проведение кальциевою сигнала к сократительному аппарату и непосредственную активацию актомиозина Рис. При этом Са2 связывается с кальмодулином СаМ, который далее взаимодействует с киназой легких цепей миозина i i i i и кальдесмоном, регуляторными белками, расположенными на актиновых филаментах . Активированная таким образом фосфорилирует регуляторные легкие цепи миозина i i и тем самым активирует гладкомышечный миозин . Однако для дальнейшего продуктивного взаимодействия миозина с актином, т. , необходимо освобождение соответствующих участков связывания на поверхности актина. В покоящейся мышце эти участки экранированы лежащим вдоль акгинового тяжа комплексом тропомиозина с кальдесмоном. Поэтому вторым необходимым условием активации актомиозина является связывание Са кальмодулина с кальдесмоном и такое изменение конформации последнего, которое вызывает изменение положения тропомиозина и экспонирование миозинсвязывающих участков на актине . Таким образом, развитие сокращения гладкой мускулатуры требует одновременной активации как миозина через его прямое фосфорилирование, так и актина путем устранения ингибирующего влияния кальдесмона.