Рестриктирующие компоненты системы хозяйской специфичности ДНК бактерий коли-дизентерийной группы

• Автор: Упорова, Татьяна Марковна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1983
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 187 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список принятых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. Обзор литературы. II

1. Биологические, энзимологические и генетические аспекты СХС у прокариот II

1.1. СХС обнаружение, свойства, распространение, функции. II

1.2. Номенклатура и классификация ферментов

1.2.1. Ферменты П класса .

1.2.2. Изомерия рестриктаз и метилаз

1.2.3. Ферменты I класса .

1.2.4. Ферменты Ш класса .

1.3. Генетические детерминанты СХС
1.3.1. Хромосомные СХС
1.3.2. Профаговые СХС
1.3.3. Плазмидные СХС
1.3.4. Распространение в факторов в
сем. ЕЫегоЪасЦег1асеае .
1.4. Заключение .
2. Методы выделения и очистки специфических эндонуклеаз .
2.1. Разрушение клеток
2.2. Удаление нуклеиновых кислот и балластных белков .
2.3. Гельфильтрация
2.4. Ионообменная хроматография .
Стр.
2.5. Аффинная хроматография
2.6. Гидрофобная хроматография
2.7. Заключение .
ГЛАВА 2. Материалы и методы.
1. Материалы.
2. Методы
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований
1. Объект исследования
1.1. Постановка проблемы и выбор объекта исследования
1.2. Культивирование штаммовпродуцентов рестриктаз
2. Рестриктирующий компонент СХС СК .
2.1. Выделение и очистка рестриктазы СК
2.2. Субстратная специфичность ееСо ск
2.3. Физическое картирование ДНК фага Я
3. Рестриктирующий компонент СХС .
3.1. Выделение и очистка.
3.1.1. Идентификация суммарной рестриктирующей активности аффинной хроматографией на голубой сефарозе
3.1.2. Ионообменная хроматография
3.1.3. Очистка IIгидрофобной хроматографией на фенилсефарозе .
3.1.4. Изоэлектрофокусирование на амфоли
нах . Ю
3.1.5. Исследование ферментных препаратов I И методом ЭЛвКТрОфореза в ПААГ И
Стр.
3.2. Свойства рестриктирующих эндонуклеаз из штамма з.Боппе1 4. П
3.3. Специфичность ИЗбо I и ЕБзо II.
3.3.1. Субстратная специфичность
3.3.2. Изучение первичной структуры участков узнавания бэбо I и йЗбо п
3.4. Использование рестриктаз из З.Бохше1
в генной инженерии
ГЛАВА 4. Обсуждение
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Полученные Чанг и Коэн экспериментальные результаты позволили сделать заключение, что по крайней мере некоторые ферменты рестрикции образуют вместе с ДНКлигазой клетки систему, осуществляющую сайтспецифическую рекомбинацию. Эти данные позволили авторам предположить, что эндонуклеазы рестрикции играют важную роль в эволюции плазмид, а возможно и хромосомного генетического материала. С другой стороны, системы рестрикциимодификации являются важным фактором половой изоляции и залогом существования вида как дискретной генетической единицы. Для обозначения рестриктаз и метилаз принята номенклатура, предложенная Смитом и Натансом в г. Согласно этим авторам, ферменты СХС обозначают в соответствии с названием вида микроорганизма, из которого фермент выделен. Например, принадлежность к . . Если один вид штамм бактерии содержит несколько ферментов рестрикции и модификации, то последние дополнительно обозначаются римскими цифрами, например, 2 I, ХтаП. Если ферменты выделяют из разных штаммов одного вида, то к названию добавляется обозначение штамма, например, В. При этом рестриктаза из этого штамма обозначается ЕЕсо в , а метилаза М В. Эта же номенклатура применительно к СХС . Классификация ферментов СХС представляет собой в основном классификацию, основанную на свойствах рестриктаз и лишь по аналогии распространяемую на метилазы. Бойер предложил деление рестриктаз на 2 класса. ФДЭ связи потребность в кофакторах для проявления активности структура молекулы фермента. Классификация Бойера в основном сохранилась до настоящего времени. Единственная корректива, внесенная новыми экспериментальными данными в эту общепринятую классификацию, состоит в выделении из I класса ферментов отдельной Шей группы см. Ферменты П класса. В самой многочисленной и наиболее широко используемой группе ферментов П класса рестриктазы гидролизуют ФДЭ связи в пределах сайта узнавания, либо, что встречается реже, как мьо II, ха I и некоторые другие, на строго фиксированном расстоянии от сайта, не превышающем, как правило, 8 нуклеотидов 4 Б результате исчерпывающего гидролиза образуется стабильный набор дискретных фрагментов. На этом свойстве основано использование ферментов рестрикции П класса для рестрикционного анализа ДНК и получения индивидуальных генов для клонирования 9,2,4,5. Сайты узнавания ферментов П класса представляют собой симметричные с осью симметрии 2го порядка или несимметричные 37членные последовательности нуклеотидов 4,4,7. Так, например, рестриктаза Ваш ж узнает палиндром 5. ТАТЩ. КэЬП гидролизует несимметричную последовательность 5. ЦЦТМАГГ. Модификационное метилирование во всех случаях происходит в сайте узнавания. ЩГГ. З. Единственным их кофактором является ме , а в случае метилаз необходимо также присутствие донора метильных групп БАМ . ДНК ферментом рестрикции и необязательно при связывании с субстратом 4,7,9. Установлено 9, что рестриктаза I , например, присутствует в растворе в форме мономера с мол. ООО Д, а при добавлении субстрата димеризуется. Для i, 1, Ват ее 8 показано, что каталитической активностью обладают димерные молекулы. Относительно активности тетрамерных форм, также присутствующих в препаратах этих рестриктаз, однозначного ответа пока нет 0. Однако по последним данным 8, две субъединицы тетрамерной молекулы i взаимодействуют с сайтом узнавания фермента и гидролизуют его, а другие две субъединицы или же совсем не связываются с молекулой субстрата, либо взаимодействуют с пониженной специфичностью. Данные о субъединичном строении молекул рестриктаз согласуются с предложенной гипотетической моделью механизма рестрикции симметричных сайтов гидролиз ДНК осуществляют две идентичные субъединицы рестриктазы, которые располагаются симметрично относительно оси 2го порядка и производят разрывы в противоположных цепях 7. В подтверждение этой модели было показано, что комплекс i с участком узнавания обладает симметрией 2го порядка 8. ДНК. Метилаза i активна в форме мономера 8, и как предполагают авторы, механизм взаимодействия МЕсо i с участком узнавания в молекуле ДНК отличается от такового для i.