Маннан-связывающие лектины из морского червя Serpula vermicularis и GlcNAc/GalNAc-специфический лектин из колониальной асцидии Didemnum ternatanum

• Автор: Ли Вэй
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 111 с. : ил.

1. Введение

2. Литературный обзор

2.1. Введение

2.2. Лектины морских беспозвоночных

2.2.1. Происхождение, локализация и биосинтез лсктииов

2.2.2. Функции лектинов в организме

2.3. Углеводная специфичность лектинов

2.3.1. Моносахариды

2.3.1.1. СаМАсОсЫАс специфичные лектины

2.3.2. Олигосахариды и полисахариды

2.3.2.1. Маннансвязывающие белки

2.3.3. Углеводсодержащие гетерополимеры
2.3.3.1. Гепаринсвязывающис лектины
2.4. Строение углеводсвязывающих сайтов лектинов
2.5. Биологическая активность лектинов
2.6. Заключение
3. Материалы и методы
3.1. Материалы
3.2. Выделение лектинов
3.2.1. Выделение ОТЬА
3.2.1.1. Получение аффинного сорбента
3.2.1.2. Приготовление экстракта асцидии ОШетпит егпШапит
3.2.1.3. Гельфильтрация ШЪА на Берйабех в
3.2.1.4. Аффинная хроматография
3.2.2. Выделение и очистка лектинов из Зегри1а ii
3.2.2.1. Получение перекрестносшитого сорбента ОуаВЭМ
3.2.2.2. Приготовление экстракта Бегри1а ii
3.2.2.3. Аффинная хроматография
3.2.2.4. Хроматография на ОЕАЕТоуореаг1
3.2.2.5. Гельфильтрация на БерЬабех
3.3. Определение молекулярной массы и гомогенности лектинов.
3.3.1. ЗОБэлектрофорез
3.3.2. Гельпроникающая хроматография.
3.3.3. Вестернблоттинг.
3.4. Твердофазный анализ взаимодействия лектинов
с гликоконъюгатами и сахарами.
3.4.1. Конъюгаты лектинов с пероксидазой из хрена ПХ
3.4.2. Взаимодействие лектинов с гликопротеинами
3.4.3. Ингибирование связывания лектинов со
специфическими гликопротеинами
3.5. Исследование физикохимических свойств лектинов
3.5.1. Эффект на взаимодействие лектинов со специфическими лигандами
3.5.2. Температурная зависимость взаимодействия лектинов с их лигандами
3.5.3. Эффект дивалентных катионов на активность лектинов.
3.6. Определение биологической активности лектинов
3.6.1. Определение цитотоксичности
3.6.2. Ингибирование репликации ВИЧ1 Шв
3.6.3. Ингибирование пектинами межклеточного слияния ингибирование синцитисобразования
4. Результаты и обсуждение
4.1. Выделение ИТЬА
4.2. Свойства ИТЬА
4.3. Выделение и очистка лектинов из Бегри1а гегпйаЛагм
4.4. Свойства лектинов из 5егргл1а Vегтки1аг
4.5. Биологическая активность лектинов
4.5.1. Цитотоксическая активность
4.5.2. АнтиВИЧ активность лектинов
4.6. Заключение
5. Выводы Благодарности Литература
.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ


Изучение пектинов из морских беспозвоночных впервые в мире было предпринято в начале века Ногути Хидэ, который первым опубликовал сообщение об их способности агглютинировать эритроциты. Многие лектины из морских беспозвоночных обладают различной биологической активностью. Так лектин из морской губки i токсичен по отношению к опухолевым клеткам и клеткам X i . Лектин из морской губки i способен ингибировать прикрепление ВИЧ к клетке хозяина Тклеткам человека . Нтимидина, изменяет морфологию опухолевых клеток Белогорцева и др. Одинцова и др. Настоящая работа посвящена выделению, характеристике и изучению углеводной специфичности лектинов из двух видов морских беспозвоночных морского червя vii и колониальной асцидии i . Целью данного исследования является выяснение биологической активности этих лектинов, в частности, как эффекторов процесса инвазии ВИЧ. Охарактеризованные лектины могут быть использованы как полезные инструменты для исследования заболеваний иммунной системы и нарушений процессов гликозилирования при различных патологиях. Углеводсвязывающие белки лектины были открыты более 0 лет тому назад i, . Однако, только в последние годы они оказались в центре внимания клеточных биологов, поскольку научные открытия последних лет показали, что углеводбелковое взаимодействие является важным механизмом передачи биологической информации на уровне клетки, то есть передачи информации при взаимодействии клеток друг с другом и межклеточным матриксом. Через углеводзависимые взаимодействия осуществляются такие важные биологические процессы как оплодотворение, проникновение патогена в клетки хозяина, миграция лейкоцитов к месту воспаления, а также процессы малигнизации и метастазирования. В настоящее время в различных областях биологических и медицинских исследований, в частности для решения проблем в области мембранологии и гликобиологии, широко используются и изучаются лектины. Лектины это общее название белков, обладающих свойством обратимо и избирательно связывать углеводы, не вызывая их химического превращения. Термин лектины от латинского выбирать, предложенный У. Бойдом, подчеркивает избирательность их взаимодействия с углеводами. В х годах его начали применять для обозначения углеводсвязывающих белков растительного и животного происхождения. Позже появились сообщения, что лектины широко распространены в биологическом мире, начиная с вирусов и кончая млекопитающими i, . Одним из главных свойств лсктинов является их избирательное взаимодействие с углеводами. Углеводы, выступая в качестве гаптенов, блокируют сайты связывания лектинов. Изучение специфичности взаимодействия лектинов с углеводами проводилось на сходном принципе блокирования активных антител гаптеном. Одна из первых классификаций лектинов, которая сохранилась и сейчас, основывается на том, что специфичность взаимодействия лектина с углеводом зависит от положения гидроксилов при 3м и 4м атомах углерода, а так же Эили Ьформы пиранозного цикла углеводов. В наше время лектины по специфичности подразделяют на четыре типа, первые два из которых наиболее широко представлены в природе 1 Стип лектины 2 Бтип лектины 3 Ртип лектины 4 и другие. Стип лектинов называется так потому, что для их связывающей активности необходимы ионы кальция. К Бтипу относятся лектины способные связывать Ргалактозиды, отсюда их второе название гапектины. Ртип лектинов является специфичным для гликопротеинов, содержащих остатки маннозо6фосфата. Среди других групп следует отметить пентраксины, характеризующиеся пентамерной субъединичной структурой и 1тип лектинов имеющих сходство с иммуноглобулинами. Различные лектины способны реагировать с редко встречающимися в обычной практике углеводами и их производными, содержащими 1 и Оацетильную группу, сиаловыми и уроновыми кислотами, дигалактозидами, пентозами, фосфорилированными и сульфатированными углеводами. Аминокислотный состав лектинов, особенно из эволюционно отдаленных организмов, существенно различается. Поэтому говорить об одном характерном типе аминокислотного состава для лектинов не представляется возможным.