Конформационные изменения растительных токсинов в ходе внутриклеточного транспорта

• Автор: Челнокова, Ольга Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с. : ил

Оглавление.

Список сокращений.

Введение

Глава 1. Об юр литературы.

1.1. Рицин и вискумин представители растительных РИБ II типа

1.1.1. Строение каталитических субъединиц рицина и вискумина

1.1.2. Строение связывающих субъединиц рицина и вискумина.

1.1.3. Взаимодействие между субъединицами рицина и вискумина.

1.2. Внутриклеточный транспорт белковых токсинов

1.2.1. Связывание с мембраной рецепторы для рицина и вискумина.

1.2.2. Интернализация токсинов внутрь клетки.

1.2.3. Везикулярный транспорт белков в клетке
1.2.4. Прохождение токсинов через эндосомальные комнартменты клетки
1.2.5. Транспорт токсинов в аппарат Гольджи
1.2.6. Ретроградный транспорт токсинов в эндонлазматический ретикулум
1.2.7. Транслокация токсинов.
Заключение.
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Клетки
2.2. Животные
2.3. Выделение рицина и его субъединиц из растения ii i
2.4. Выделение токсинов и их субъединиц из растения Vi .
2.5. Получение гибридом, продуцирующих антитела против Асубъединицы рицина.
2.6. Получение гибридом, продуцирующих антитела против Всубъединицы вискумина
2.7. Получение и очистка антител.
2.8. Определение изотипа антител.
2.9. Биотинилирование белков
2 Изучение взаимодействия антител с антигеном с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.
2 Конкурентный иммуноферментный анализ
2 СэндвичТИФА на основе иолученых монАг
2 Оценка галактозосвязывающей активности токсинов
2 Диссоциация субъединиц рицина и вискумина под действием дитиотреитола.
2 Влияние монАт против на взаимодействие вискумина и его Вцепи с асиалофетуином
2 Клеточный ИФА.
2 Изучение рециклинга вискумина клетками ТА.
2 Влияние гуанидингидрохлорида на экспонирование эпитопа, узнаваемого антителами ТА.
2 Пептидный ТИФА
2 Оценка цитотоксической активности токсинов
2 Бесклеточная система трансляции.
2 Электрофорез в системе Лэммли.
2 Иммуноблопинг.
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Изучение механизма действия рицина и вискумина на стадии внутриклеточной диссоциации.
3.2. Ингибирующее действие вискумина на гибридомы, синтезирующие антитела против его связывающей субъединицы
3.3. Конформационные изменения Асубъединицы вискумина при внутриклеточной транслокации
Выводы
Список литературы


Она связывается с рецепторами на клеточной поверхности и обеспечивает интернализацию токсина внутрь клетки. Строение каталитических субъединиц рицина и вискумина. Рицин является наиболее изученным представителем РИБ II тина. Это кДа гликопротеин, выделенный из семян растения Клещевины обыкновенной ii i. Изолированная Асубъединица рицина состоит из 7 аминокислот и содержит два сайта гликозилирования. Структура была изучена в деталях с помощью рснтгеноструюуриого анализа РСА с разрешением 2,3 . Анализ показал, что является глобулой, по форме напоминающей удлинненный диск . . Домен I включает 7 концсвых аминокислот и состоит в основном из аспиралсй, домен II 80 аминокислотные остатки содержит пять III 17 аминокислотные остатки содержит в основном аспирали и взаимодействует как с двумя другими доменами, так и с Всубъсдиницсй. Данные РСА свидетельствуют, что в построении активного центра участвуют вес три домена. Мутантные , лишенные аминокислотных остатков с СООНконца или остатков с ЫН2конца, одинаково ферментативно не активны . Активный центр содержит ряд консервативных аминокислотных остатков , 3, 1 7, 10, Тф, точечный мутагенез которых приводит к значительной или полной потере каталитической активности. Аминокислотная последовательность Асубъединицы вискумина включает 4 остатка . состоит из а и Подобно Ацепи рицина, в составе Асубъединицы I можно выделить три домена. Домен I состоит из одного спирального участка и семи Второй домен содержит пять аспиральных участков. Третий домен содержит один спиральный участок и два антипараллельных Интересно, что, как описано выше, в Асубъединице рицина, имеющей также трехдоменное строение, в третьем домене отсутствуют Вернослова Е. А. и др. содержит один 7, участвующий в образовании дисульфидной связи с Всубъединицей. Внутренние дисульсуфидные связи в отсутствуют. Данные РСА свидетельствуют, что в построении активного центра , также как и , участвуют все три домена. Туг ,Туг , , , Тф . , , i , участвуют в поддержании структуры активного центра . Показано, что аминокислотные остатки, входящие в активный центр Асубъединицы вискумина, идентичны таковым у рицина . Строение связывающих субъединиц рицина и вискумина. Связывающая Всубъсдиннца рицина состоит из 2 аминокислотных остатков, которые образуют два отдельно свернутых домена сферической формы с диаметром А . В каждом домене Всубъединицы имеется галактозосвязывающий участок. является гликопротсином с молекулярной массой около кДа, содержащей два сайта глнкозилирования. Определены критически важные для взаимодействия с галактозой аминокислоты в двух сайтах связывания сахара . Между доменами Всубъсдиницы рицина наблюдается выраженная гомология аминокислотных остатков Vii . Каждый домен Всубъединицы рицина состоит из четырех субдомснов X, а, 5 и у. Субдомены а, Субдомсны л отличаются от остальных субдоменов и составляют первые аминокислотных остатков каждого домена. Субдомен IX, состоящий из 1 аминокислотных остатков, соединяет А и Всубъсдиннцы, тогда как субдомсн 2Х 50 аминокислотные остатки соединяет между собой два домена Всубъсдиницы . В каждом домене сх и Девять остатков цистсина Всубъсдиницы рицина образуют четыре внутримолекулярные дисульфидныс связи и одну е Асубъсдиницсй. Рицин имеет два углеводсвязываклцих центра. Первый локализован в субдомене IX. Каждый галактозосвязывающий центр представляет собой неглубокий карман на поверхности белка, в образовании которого участвуют с одной стороны остаток ароматической аминокислоты, а с противоположной пептид из трех аминокислотных остатков. Ароматическая аминокислота Тгр и пептид, состоящий из , V, , образуют первый галактозевязывающий участок. Туг и пептид 6V формируют второй галакгозевязывающий участок .