Исследование причин токсичности удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина в дрожжах Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Бочарова, Наталья Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Наследственные нейродегенеративные заболевания.

1.1 Генная терапия в лечении нейродегенеративных заболеваний. .

1.2 Болезнь Альцгеймера.

1.3 Болезнь Паркинсона

1.4 Нейродегенеративные заболевания, связанные с удлинением полиглутаминового фрагмента.

Глава 2. Болезнь Хантингтона

2.1 Распространенность и клинические проявления болезни Хантингтона.

2.2 Структура и функции хантингтина.

2.3 Взаимодействие хантингтина с факторами транскрипции

2.4 Клеточная модель патогенеза болезни Хантингтона.
2.5 Подходы к лечению болезни Хантингтона.
Глава 3. Потенциальные механизмы токсичности хантингтина факты и гипотезы
3.1 Образование агрегатов и токсичность.
3.2 Инактивация транскрипционных факторов.
3.3 Протеасомный стресс и регуляция клеточного цикла
Глава 4. Использование дрожжей vii в качестве модели для изучения токсичности полиглутаминов
4.1 Дрожжи как экспериментальная модель для изучения программируемой клеточной гибели
4.2 Моделирование агрегации и токсичности полиглутаминов на дрожжах
4.3 Преимущества и ограничения дрожжевой модели
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 1. Материалы исследования
1.1 Генотипы использованных штаммов дрожжей.
1.2 Генотипы использованных штаммов бактерий
1.3 Генетические конструкции, плазмиды
1.4 Реактивы, ферменты, буферы
Глава 2. Культивирование дрожжей.
2.1 Условия культивирования.
2.2 Среды для культивирования.
2.3 Оценка выживания по КОЕ
Глава 3. Микроскопия.
3.1 Оценка выживания по окрашиванию клеток
3.2 Окрашивание клеток на ДНК.
Глава 4. Биохимические методы
4.1 Экстракция белков из дрожжевых клеток.
4.2 Электрофоретическое разделение белков в ПААГ
4.3 Оценка уровня карбонилирования белков.
4.4 Измерение скорости поглощения кислорода.
Глава 5. Молекулярнобиологические методы
5.1 Выделение геномной ДНК из дрожжей.
5.2 Выделение плазмидной ДНК из бактерий
5.3 Горизонтальный гельэлектрофорез ДНК
5.4 Выделение ДНК из агарозного геля
5.5 Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции.
5.6 Реакция дефосфорилирования
5.7 Реакция лигирования.
5.8 Полимеразная цепная реакция.
5.9 Трансформация бактериальных клеток
5. Трансформация дрожжей
5. Секвенирование.
Глава 6. Комплексные методики.
6.1 Получение мутантных линий с полностью инактивированным
6.2 Общая схема генетического скрининга.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Глава 1. Исследование токсических свойств полиглутаминового фрагмента хантингтина на дрожжевой модели.
Глава 2. Исследование агрегации полиглутаминового фрагмента хантингтина на дрожжевой модели
Глава 3. Исследование программируемой клеточной гибели дрожжей, вызванной экспрессией удлиненного
полиглутаминового фрагмента хантингтина
3.1 Признаки программируемой клеточной гибели, детектируемые при экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина в дрожжах
3.2 Влияние антиоксидантов на выживаемость и колониеобразующие свойства дрожжей, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина.
Глава 4. Исследование функции гена УСА1.
4.1 Влияние гена УСА 1 на ядерную локализацию агрегатов полиглутаминового фрагмента хантингтина.
4.2 Оценка уровня карбонилированных белков в штаммах, экспрессирующих полиглутаминовый фрагмент
4.3 Влияние гена УСА1 на выживаемость и колониеобразующую способность клеток, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина
4.4 Влияние экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина и гена УСА1 на клеточный цикл
Глава 5. Скрининг генов, вовлеченных в проявление токсичности удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина
5.1 Описание скрининга.
5.2 Результаты скрининга.
5.3 Анализ полученных мутантов на устойчивость к экспрессии
удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина
Глава 6. Исследование функции гена АБЕ
Глава 7. Исследование функции генов СйН1 и СЬВ
ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Тот факт, что дрожжи vii представляют собой эукариотические клетки с коротким жизненным циклом, которые имеют сравнительно небольшой и хорошо охарактеризованный геном и могут быть подвержены сравнительно простым генетическим манипуляциям, делает их уникальной модельной системой для изучения молекулярных основ болезней старения и связанной с этим программируемой клеточной гибели. В дальнейшем оказалось, что цитологические последствия экспрессии полиглутаминовых фрагментов в линиях клеток многоклеточных эукариот и в дрожжах vii схожи по целому ряду параметров и, помимо всего прочего, приводят к индукции программированной гибели v . В настоящее время для изучения молекулярных и биохимических основ явлений, наблюдаемых при связанных со старением нейродегенеративных расстройствах, предлагается использование в качестве модели дрожжевых клеток, находящихся в стационарной фазе роста , . На такой модели воспроизводятся многие патологические процессы, происходящие при старении и дегенерации нейронов, включая усиление окислительного стресса и ингибирование протеасомного комплекса белков. Сравнительная простота генетических манипуляций позволяет выявить гены, активирующие клеточные механизмы ответа на стрессовые факторы, и использовать полученные результаты для лучшего понимания генной регуляции постмитотического старения нейронов. Одним из главных преимуществ дрожжевой модели является удобство проведения поиска генов, вовлеченных в развитие патологического процесса, вызванного экспрессией удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина. Перед нами стояла задача выяснить последовательность и взаимосвязь процессов, приводящих к проявлениям токсичности мутантного полиглутаминового фрагмента для дрожжей. Если дрожжи, экспрессирующие фрагмент хантингтина с удлиненным полиглутаминовым доменом, трансформировать транспозонной библиотекой для инактивации случайных участков генов, то можно
отобрать и идентифицировать мутантные линии, для которых токсичность этого фрагмента будет проявляться в меньшей степени, чем для контрольного штамма. Определив положение вставки, можно узнать, какие гены вовлечены в патологический процесс и каков вероятный механизм развития токсичности. Проведение такого скрининга и выяснение роли найденных генов в развитии патологии при возникновении болезни Хантингтона были поставлены в качестве основной задачи данной работы. Поскольку клеточные и молекулярные признаки токсичности у дрожжей и нейронов схожи, есть основания полагать, что полученные данные позволят выявить некоторые общие закономерности развития патологии и будут способствовать поиску новых методов лечения болезни Хантингтона. Глава 1. Существует целый класс генетических заболеваний человека, которые характеризуются нарушениями памяти, мыслительной деятельности, координации движений и других функций организма, связанных с деятельностью головного мозга. Эти заболевания вызваны, как правило, гибелью клеток нервной системы, связанной с мутациями в ключевых генах, и называются нейродегенеративными. Нейродегенеративные заболевания обусловлены дегенерацией определенных отделов центральной нервной системы ЦНС, что влечет за собой нарушение выработки нейромедиаторов и регуляции ЦНС в целом. Большинство этих заболеваний считаются в настоящее время неизлечимыми, поскольку традиционные методы фармакотерапии и нейрохирургического лечения дают лишь кратковременный положительный эффект. Часто такие наследственные заболевания рассматриваются как нарушения, связанные с потерей функции одного или нескольких генов. Однако гипотеза один ген один белок одна функция в настоящее время чаще опровергается, чем подтверждается. Одним из примеров опровержения этой гипотезы является наличие ряда нейродегенеративных заболеваний, таких, как болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона, а также прионных энцефалопатий и цистических фиброзов . Общим свойством этих заболеваний является образование агрегатов из неправильно свернутых и потерявших свою функцию белков, что в конечном итоге приводит к гибели нейронов.