Исследование взаимодействия протеолитического и АТР-азного центров нативной Lon-протеиназы Escherichia coli и её мутантных форм

• Автор: Цирульников, Кирилл Борисович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

СУБСТРАТЫ ПРОТЕИНЛЗЫ . i ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Функции внутриклеточного протсолиза. Протсолитическис ферменты.

2. Краткая характеристика протеиназы.

3. Внутриклеточные функции протеиназы

3.1. Участие протеиназы в регуляции ответа на тепловой шок и в деградации аномальных белков.

Деградация офактора.

3.2. Роль протеиназы в регуляции ответа

Деградация x, , ,

3.3. Регуляция капсульного синтеза.

Деградация
3.4. Участие нротеиназы в индукции профагов.
Деградация и Xiбелков фага лямбда
3.5. Участие протеиназы в стабилизации плазмид.
Деградация , В,
3.6. Другие мишени протеиназы . i.
Деградация i, транспозазы I3, , , x
4. Участие шаперонов в функционировании протеиназы.
5. Функции протеиназ эукариот.
6. Субстраты протеиназы i vi.
7. Принципы узнавания субстратов протенназой
8. Локализация субстратузнающих участков в протеиназе.
9. Заключение
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
I. Основные задачи и объекты исследования.
II. Выбор субстратов для исследования функционирования протеолитических центров протеиназы.
III. Особенности олигомерного состояния протеиназы и ее мутантных форм.
1. Исследование четвертичной структуры с помощью гельфильтрации.
2. Аналитическое ультрацентрифугирование протеиназы.
2.1. Определение олигомерной структуры протеиназы по скорости седиментации
2.2. Определение олигомерной структуры протеиназы методом седиментации активного фермента.
IV. Закономерности функционирования протеолитических центров протеиназы.
1. Влияние температуры и на пептидгндролазную и АТРазную активность протеиназы и ЬопК2мутанта.
2. Кинетика гидролиза низкомолекулярного субстрата нативной и модифицированными формами протеиназы.
3. Комплементация мутаций 2 и 9.
4. Влияние нуклеотидмагниевых комплексов и их компонентов на гидролиз низкомолекулярного субстрата нрогеиназой и ее
модифицированными формами
5. Ингибирование аденозиндифосфатом тиоэстеразной активности протеиназы.
6. Влияние мелиттина и казеина на гидролиз
нативной протеиназой и 2.
7. Гидролиз мелиттина нативной и модифицированными формами
протеиназы.
8. Гидролиз казеина протеиназой.
9. Аутолитическая активность протеиназы.
V. Функционирует ли диада в активном центре протеиназы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В цитоплазме эукариот практически все протеолитические процессы осуществляются большими комплексами протеасомами, которые узнают мишени, меченные специфической маркерной молекулой убикитином членный полипептид с помощью полиферментной убикнтинконъюгирующей системы рис. Узнавание субстратов осуществляется одним из ферментов этой системы ЕЗ. В некоторых органеллах высших организмов митохондриях и эубактериях отсутствует единый протеолитический комплекс, но обнаружен ряд энергозависимых протеаз, большинство из которых являются стрессиндуцибельными. . i это зависимые протеазы , , X, V, . В других прокариотических клетках также обнаружены гомологичные системы, а в некоторых протеасомы 5. В бактериальных клетках отсутствует убикитинконыогирующая система, поэтому протеиназы узнают свои мишени без помощи других ферментов по какимлибо общим структурным принципам. Ч Е1. Рис. Схема зависимого протеолиза в эукариотах с участием протеасомы. Сконцевой области гидрофобного додекапептида с участием специфической молекулы РНК 6. Несмотря на различия структур протеасом и протеолитических ферментов прокариот большинство зависимых протеиназ имеет схожую архитектуру это большие белковые комплексы, содержащие несколько АТРазных и протеолитических центров. И только в протеипазе и протеииазе I . АТРазный и протсолнтический активные центры находятся в составе одной полипеитидной цепи в разных доменах, в то время как в других протеазах X, V, протеасомы АТРазные и протеолитнчсскис центры находятся на различных субъединицах табл. Четвертичная структура протеасом и АТРзавнсимых протеаз, за исключением и , схожа во всех случаях протеолитнчсскис субъединицы ассоциированы в кольца, уложенные друг над другом и фланкированные с одного или обоих концов кольцами ассоциированных АТРазных субъединиц образуя при этом бочкоподобные комплексы 5. Схема строения протеасомы приведена на рис. Комплекс состоит из протсолитичсского кора, включающего 2 кольца по 7 асубъединиц и 2 кольца но 7 АТРазного компонента, осуществляющего, повидимому, функции узнавания, разворачивания и транслокации субстрата в протеолитическую камеру и активации пептидгидролазных центров. Примечательно, что все а и Табл. АТРзависнмые протеиназы Е. Протеиназа Ген Кво а. Мол. Ьоп Ьа оп 4 0 4 СрХР срХ 4 0 Рис. Схема строения Б протеасомы. АТРазного компонента и построены из одинаковых а и Рсубъединнц 7. Внутри протеолитическнх комплексов образуется центральная полость, в которой и происходит протеолиз доступ к такой полости возможен через специальный канал, образованный в центре структуры. Через такой канал проникают лишь субстраты данных протеаз, что обеспечивает их селективный отбор и предотвращает нежелательный протеолиз. Для удаления таких крупных фрагментов требовались бы дополнительные протеолнтические структуры, причем ввиду отсутствия в цитоплазме компартментов токсичные фрагменты могли бы быстро диффундировать в объем, и время их жизни значительно возросло бы. Роль гидролиза АТР в данном процессе сводится i к катализу гидролиза пептидной связи, поскольку се расщепление самопроизвольный процесс, не требующий энергетических затрат, а к регуляции взаимодействия различных субъединиц с субстратом, в результате чего обеспечивается узнавание и процесснвная деградация субстратов. протеиназа . зависимые прокариотические протеазы, однако наличие четвертичной структуры и процессивность функционирования фермента предполагает схожий механизм узнавания и деградации белковых субстратов. протеиназа . Основные характеристики протеиназы . Фермент является белком теплового шока, т. Индукция гена I может происходить при накоплении аномальных для клетки белков. протеиназа представляет собой гомоолигомерный фермент. протеиназа является ДИКсвязывающим белком. Протеолнтический и АТРазиый активные центры локализованы в разных доменах в составе одной полипептидной цепи.