Исследование влияния ряда биологически активных веществ на активность теломеразы в бесклеточной системе in vitro

• Автор: Зимник, Ольга Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Структура и функции тсломер.

1.2. Структура и функции теломеразы.

1.3. Теломерная гипотеза клеточного старения и имморгализаиии.

1.4. Активность теломеразы и опухолевых клетках человека

1.5. Экспрессия теломеразы в нормальных клетках человека

1.6. Регуляция длины геломер и активности тсломерачы

1.7. Ингибиторы теломеразы

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1 Материалы.
2.1.1. Реактивы.
2.1.2. Олигонуклеотиды
2.1.3. Клеточные линии
2.1.4. Клинический материал.
2.2. Методы исследования
2.2.1. Выделение лимфоцитов из периферической крови.
2.2.2. Получение экстрактов из лимфоциюв и клеток опухолевых линий
2.2.3. Анализ активности теломеразы.
2.2.4. Постановка контролей на ннтибированис соединениями
Тац ДИКнолимеразы в системе амплификации фрагмента гена
1глобина человека.
2.2.5. Очистка продуктов теломсразиой реакции методом осаждения
2.2.6. Очистка продуктов теломсразиой реакции методом ультрафильтрации
2.2.7. Определение ингибирующей активности соединений
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Определение активности теломеразы в экстрактах клеток
опухолевых линий с помощью модифицированного метода ТИАР
3.2. Определение активности теломеразы в экстрактах лимфоцитов
больных гсмобластозаыи
3.3. Исследование влияния на активность теломеразы
некоторых производных нухлеозилов.
3.4. Исследование влияния на активность теломеразы
производных пиридокенна, эфиров нуклеотидов с бифосфоновыми кислотами и некоторых других соединений.
3.5. Исследование влияния на активность теломеразы
производных ретиноевой кислоты
3.6. Исследование влияния на активность теломеразы фосфоднэфирных
и фосфоротиоатпых синтетических олигонуклеотидов
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Многие авторы считают, что кроме диагностических тестов теломераза может най ти применение и и качестве прогностического маркера, поскольку для некоторых видов опухолей была обнаружена корреляция между активностью теломеразы и определенными клииихопатологическими показателями . Диагностический и прогностический потенциал теломеразы как наиболее специфичного и универсального на сегодняшний день опухолевого маркера требует дальнейшего проведения широких клинических исследований. Для этих целей необходимо также усовершенствование методов количественного определения активности теломеразы. Возможность практического применения теломеразы в онкологии распространяется не только на диагностику и прогнозирование исхода заболевания. Наибольшую ценность может иметь использование данного фермента в качестве терапевтической мишени. Как указывалось выше, активация теломеразы является специфической характеристикой раковых клеток, поэтому избирательное воздействие на нее может стать основной целью при создании нового класса противоопухолевых препаратов. Основываясь на данных, полученных при изучении свойств теломеразы, в настоящее время уже ведется поиск ее ингибиторов 4. В начале х годов нашего столетия Леонардом Хейфликом и Полом Мурхедом была опровергнута существовавшая несколько десятилетий главная догма клеточной биологии, гласившая, что нормальные клетки имеют неограниченную способность к размножению. С помощью серии экспериментов было убедительно показано, иго потенциал делений нормальных фибробластов человека в культуре строго ограничен. Старение и смерть таких клеток неизбежно наступаюг примерно после удвоений популяции. Конечная продолжительность жизни культур нормальных клеток человека была объяснена авторами как проявление старения на клеточном уровне к названа феноменом фазы III . Между тем, генеративные клетки, линии нмморгализованиых клеток в культуре и раковые клетки преодолевают ограничения клеточной репликации и старение. Было высказано предположение, что уникальные характеристики этих типов клеток являются коренными предпосылками неограниченного роста. Со времени появления сообщений об ограниченной способности нормальных клеток к размножению основной задачей многих исследователей стал поиск механизма, определяющего этот предел, а также способа, с помощью которого иммортализованные клетки обходят ограничение. В начале х годов, после прояснения механизма репликации ДНК, было указано на существование проблемы неполного копирования ДНКполимсразой концов линейных молекул ДНК при каждом цикле деления клетки I, 9. В результате неполного копирования ДНК всякий раз укорачивается на несколько нуклеотидов. В своей Теории марпшотомин Д. Кроме того. Оловииков предположил, что ограниченный потенциал делений клеток является основополагающей причиной старения организма, и что в нммортализованных клетках существует механизм, позволяющий решать проблемы концевой репликации 7. В качестве возможного варианта решения данной проблемы автор рассмотрел компенсацию утраченных участков ДНК за счет синтеза специальных структур последовательностей нуклеотидов, не содержащих генетической информации. Предсказанное Оловниковым укорочение линейных хромосом в соматических тканях при каждом цикле репликация ДНК было подтверждено лишь несколько лет назад. В ходе исследований было показано, что подобное укорочение концевых участков хромосом теломер является функцией возраста донора при исследовании первичных образцов тканей и продолжительности роста i vi в случае зкенлантированных культур тканей 4. На основании экспериментальных данных Леви и соавг. I После появления новых данных о структуре и динамике теломер теория маргинотомин А. Оловникова привлекла большое внимание как теломерная гипотеза клеточного старения. Более того, был открыт предсказанный Оловниковым механизм, с помощью которого нымортализованные клетки решают проблему укорочения ДНК в 5 г. Грейдер и Блэкберн обнаружили фермент, замещающий утраченные последовательности концевой ДИК . Открытие этого фермента, получившего название теломераза, наряд с экспериментальным доказательст вом укорочения гсломер при делении клеток стало большим шагом на пути к пониманию сути процессов старения, иммортализации и онкогенеза.