Исследование обмена компонентов эндогенного ингибитора моноаминооксидаз- трибулина- и его взаимодействие с ферментами in vivo и in vitro

• Автор: Панова, Наталья Геннадьевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил

Содержание Стр

Список сокращений

Глава 1.Обзор литературы

1.1 Характеристика фермента.

1.2 Создание и изучение моделей субстратсвязывающих участков моноаминоксидазы.

1.3 Ингибирование моноаминооксидаз.

1.3.1 Необратимые ингибиторы.

1.3.1.1 Свойства некоторых ацетиленовых ингибиторов.

1.3.1.2 Измерение концентрации моноаминооксидазы.

1.3.1.3 Механизм ингибирования.

1.3.2 Обратимые ингибиторы МАО.

1.3.3 Характеристика эндогенных ингибиторов МАО.
1.3.4 Пути изучения действия эндогенных ингибиторов i viv.
Глава 2. Материалы и методы. v4. .,чч
2.1 Эксперименты i viv. Условия алкоголизаций животных.
2. 2 Выделение митохондрий печени крысы и фракции внешних мембран.
2.2.1 Выделение митохондриальной фракции печени крысы.
2.2.2. Получение внешних мембран митохондрий
2.2.3. Определение активности сукцинатдегидрогеназы.
2.2.4. Определение активности моноаминооксидазы радиометрическим
методом
2.3 Выделение фракции трибулина из мозга крысы.
2.4 Защита МАО изатином от действия необратимых ингибиторов.
2.5 Исследование путей синтеза 4гидроксифенилэтанола i vi.
2.5.1 Получение препаратов трибулина из мозга быка.
2.5.2. Очистка препаратов трибулина мозга быка.
2.5.3. Подготовка препаратов трибулина для анализа методом ГХМС.
2.5.4. Определение 4гидроксифенилэтанола во фракции трибулина методом
газовой хроматографии массспектрометрии.
2.6. Исследование окислительной деградации изатина
2.6.1. Условия инкубации с биологическими генераторами перекиси
водорода
2.6.2. Определение антраниловой кислоты методом тонкослойной хромато
графии.
2.7. Определение изатинсвязывающей активности препаратов
методом оптического биосенсора
2.7.1.1. Принцип метода
2.7.1.2. Иммобилизация 5аминоизатина
2.7.2. Исследование изатинсвязывающей активности методом оптического биосенсора
2.7.2.1 Контрольные препараты митохондриий.
2.7.2.2 Препараты митохондрий, обработанные различными ингибиторами моноаминооксидаз.
2.7.2.3 Препараты внешних мембран митохондрий.
2.7.2.4 Препараты мембранной и растворимой фракций различных отделов головного мозга крысы.
2.7.2.5 Исследование изатинсвязывающей активности некоторых цитозольных ферментов ксантиноксидазы, лактатдегидрогеназы
и глицеральдегид3фосфатдегидрогеназы.
2.7.3. Расчет констант взаимодействия.
Результаты
Глава 3. Исследование роли трибулина А мозга и путей синтеза его
основного компонента 4гидроксифенилэтанола
3.1. Влияние хронической алкоголизации крыс на активность МАО
и содержание трибулина в мозге.
3.2. Определение компонентов трибулина в спиномозговой жидкости
человека.
3.3. Исследование путей биосинтеза 4гидроксифенилэтанола.
Глава 4. Изучение путей окислительной деградации изатинакомпонента трибулина В в модельных системах и i vi.
4.1. Защита изатином моноаминооксидаз от необратимой инактивации
4.2. Исследование окислительной деградации изатина в модельных перекисьобразующих ферментных системах.
4.3. Исследование окислительной деградации изатина при инкубации
с препаратами митохондрий печени крысы.
Глава 5. Исследование тканевого и субклеточного распределения
изатинсвязывающих участков.
5.1. Изатинсвязывающая активность мембранной и растворимой фракций мозга, сердца и почек.
5.2. Взаимодействие иммобилизованного изатина с препаратами митохондрий и растворимой фракцией печени
5.3. Влияние необратимых ингибиторов на взаимодействие иммобилизованного изатина с митохондриями печени крысы.
5.4. Взаимодействие иммобилизованного изатина с некоторыми индивидуальными белками.
Глава 6. Обсуждение результатов.
Выводы. ПО
Список литературы


МАО А обладает высоким сродством к следующим моноаминам субстратам серотонину, норадреналину, дофамину и чувствительна к низким концентрациям хлоргилина в то время как МАО В катализирует дезаминирование фенилэтиламина, бензиламина и ее активность тормозят низкие концентрации депренила. Обе формы фермента располагаются во внешней мембране митохондрий и кодируются различными генами , Рамсэй, , Сквайерс , i . При изучении содержания МАО А и В в мозге были обнаружены следующие особенности их распределения. Например, МАО А локализована преимущественно в катехоламинергических нейронах, МАО В сконцентрирована в серотонинергических, гистаминергических нейронах, глиальных клетках и астроцитах i , . Наиболее высокая концентрация МАО А и В в ядрах шва. Распределение фермента по другим биологическим объектам различно для одного и того же организма. Например, тромбоциты человека, печень и почки быка содержат преимущественно МАО В плацента человека и щитовидная железа быка отличаются высоким содержанием МАО А скелетные мышцы крысы содержат незначительные количества обеих форм , Горкин, Медведев . Сравнение аминокислотной последовательности А и В форм , показало, что ферменты имеют молекулярную массу 0 и 0 Да соответственно и идентичны на . Ххромосомы, и асоциальные отклонения в поведении людей преимущественно мужчин связаны с нарушением экспрессии этих генов , , Рамсэй, Сквайерс , а мутации гена, кодирующего МАО А приводит к эмоциональным расстройсвам у мышей i , . Согласно сообщениям последнего десятилетия , , , были обнаружены белкирегуляторы активаторы и репрессоры транскрипции генов МАО А и В. Использование современных методов генной инженерии позволило выяснить структурные особенности МАО А и МАО В, что необходимо для понимания механизмов функционирования фермента. Оказалось, что в первичной структуре фермента есть несколько высоко консервативных участков. В случае МАО В это связывающий участок с 6 по аминокислотные остатки, субстратсвязывающий домен остаток, сайт ковалентного связывания с остаток и Сконцевой участок остаток , i, , . Каждый из этих участков подвергался затем дальнейшему исследованию взаимосвязи структуры и функции. Обмен концевых связывающих участков между МАО А и МАО В не изменял субстратную или ингибиторную селективность по сравнению с природными ферментами. Мутагенез остатков глутамина , и тирозина , расположенных в связывающем домене МАО В человека, сильно понижали каталитическую активность. Замена части полипептидной цепи связвающего участка Сконцевого домена МАО А остатки на соответствующий участок МАО В также не влияют на субстратную или ингибиторную селективность. МАО В. Перемещение определенных частей полипептидной цепи от МАО А к МАО В полностью изменяло субстратную и ингибиторную ориентацию форм фермента. В параллельных экспериментах на МАО крысы было доказано, что область между остатками 0 и 0 ответственна за субстратную специфичность МАО А и МАО В , I . Теми же авторами в последующих экспериментах было показано, что замена ароматической аминокислоты 8 на алифатическую Не у МАО А и наоборот, замена I9 на у МАО В частично меняют субстратную специфичность соответствующих форм фермента , I . Однако дальнейшие исследования показали, что эти аминокислоты не отвечают за все отличия в субстратной спецефичности и ингибиторной селективности Веселовский и др. Медведев и др. Исследования на МАО других животных обнаружили, что замена некоторых цистеиновых остатков 4, 6 для МАО А и 6, 5, 7 для МАО В на серии приводит к снижению каталитической активности на при замене цистеина на аланин фермент теряет активноть полностью Рамсэй, МАО А и МАО В содержат в активном центре редоксактивный дисульфид i, . Используя методику направленного мутагенеза, авторы , показали, что Ие5 МАО А и Туг6 МАО В ответственны за субстратную и ингибиторную специфичность моноаминооксидаз человека. В более поздних экпериментах установлена принадлежность 4 и 5 к числу аминокислот субстат связывающего сайта i, Рамсэй, . То, что при замещении i2 на и 8 на у МАО В происходит изменение свойств фермента, означает влияние электростатических в частности нуклеофильных, пространственных эффектов в определенных участках молекулы и сил слабого взаимодействия.