Иммунореактивные консервативные участки оболочечных гликопротеинов вируса гепатита С

• Автор: Оленина, Людмила Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 157 с. : ил

Оглавление стр

1 Введение

2 Обзор литературы

2.1 Антигенные детерминанты белков и методы их поиска

2.1.1 Антигенность и иммуногенность белков

2.1.2 Типы Вэпитопов

2.1.3 Теоретические методы поиска Вэпитопов

2.1.4 Экспериментальные методы картирования Вэпитопов

2.1.4.1 Рентгеноструктурный анализ комплексов антигенантитело

2.1.4.2 Фрагментация белкового антигена

2.1.4.3 Химический синтез олигопептидов

2.1.4.4 Генноинженерные методы
2.1.4.5 Применение комбинаторных библиотек
2.1.4.6 Пептидное сканирование
2.1.5 Антигенное картирование как этап в исследовании белков и применение антипептидных антител
2.2 Оболочечные гликопротеины вируса гепатита С
2.2.1 Классификация и морфология вируса
2.2.2 Структура генома ВГС и краткая характеристика продуктов его экспрессии.
2.2.3 Генетическая гетерогенность ВГС
2.2.4 Фолдинг, ассоциация и внутриклеточная локализация оболочечных гликопротеинов
2.2.5 Гуморальный иммунный ответ к ВГС
2.2.5.1 Общие характеристики гуморального иммунного ответа
2.2.5.2 Гуморальный иммунный ответ к оболочечным белкам ВГС
2.2.5.3 Эпитопное картирование оболочечных белков ВГС
2.2.6 Возможные рецепторы для ВГС
2.2.6.1 Рецептор липопротеина низкой плотности
2.2.6.2 Гепарансульфат
2.2.6 3
2.2.7 Перспективы создания вакцины против ВГС
3 Материалы и методы
3.1 Химические реагенты и биологические препараты
3.2 Оборудование
3.3 Методы
3.3.1 Синтез пептидов на полиэтиленовых иглах
3.3.2 Иммуноферментный сорбционный анализ I пептидов на иглах
3.3.3 Иммуноферментный сорбционный анализ с иммобилизованными на планшете пептидами
3 3.4 Конкурентный иммуноферментный анализ для сыворотки крови
3.3.5 Статистический анализ полученных данных
3.3.6 Определение консервативности пептидных фрагментов из оболочечных гликопротеинов ВГС
3.3.7 Получение конъюгатов пептидов I и II с гемоцианином лимфы улитки
3.3.8 Получение конъюгатов пептидов I и II с овальбумином
3.3.9 Получение конъюгата пептида I с БСА
3.3. Приготовление антипептидных мышиных сывороток
3.3. Определение титра антипептидных антител в полученных антисыворотках
3.3. Проведение конкурентного иммуноферментного анализа для антисывороток к пептиду I
4 Результаты и обсуждение
4.1 Эпитопное картирование высоко консервативных участков оболочечных белков ВГС
4.1.1 Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей оболочечных гликопротеинов ВГС
4.1.2 Синтез и характеристика перекрывающихся пептидов
4.1.3 Тестирование сывороток на взаимодействие с пептидами
4.1.4 Взаимодействие антител из сывороток крови пациентов в острой фазе ВГСинфекции с пептидами
Взаимодействие антител из сывороток крови пациентов в хронической фазе ВГСинфекции с пептидами
Сравнительный анализ исследованных групп сывороток по иммунореактивности с оболочечными белками ВГС Построение антигенной карты оболочечных белков ВГС Получение антипептидных антител
Выбор пептидов для получения антипептидных антител Получение конъюгатов пептидов I и II с белками Иммунизация лабораторных животных Характеристика специфических антител в антисыворотках Титры антипептидных антител к пептиду I Титры антипептидных антител к пептиду II
Определение Вэпитопной специфичности антипептидных антител
Конкурентный иммуноферментный анализ антипептидных антител
из антисывороток к пептиду I
Заключение
Список литературы
Введение
Актуальность


Продукты экспрессии множества генов еще не установлены или недостаточно охарактеризованы. Одним из подходов к идентификации и выяснению биологических функций различных белков является применение синтетических или рекомбинантных пептидов, имитирующих функционально важные участки белков. Особенно успешно такой подход применяется для изучения антигенных свойств белков. Под антигенностью белка понимают его способность связываться специфично с антигенсвязывающим участком специализированных белковых молекул иммуноглобулинов антител и, в процессированном виде, с Тклеточными рецепторами. Та часть антигена, которая специфично узнается антигенсвязывающим участком паратопом антитела, называется Вклеточной антигенной детерминантой или Вэпитопом данного антигена. МНС перемещаются на поверхность клетки и становятся доступными для узнавания Тклеточными рецепторами Роит и др. Этот обзор посвящен только Вклеточным антигенным детерминантам и вопросам Вэпитопного картирования. Участок поверхности антигена, находящийся в контакте с молекулой антитела и оцениваемый по данным рентгеноструктурного анализа как область в А2 составляет структурный эпитоп V , . Вся поверхность белка может рассматриваться как область перекрывания большого числа эпитопов i . Те же самые аминокислотные остатки могут входить в состав различных эпитопов, взаимодействующих с различными антителами . По современным представлениям узнавание между эпитопом и паратопом происходит за счет небольших групп атомов и индивидуальных атомов аминокислотных остатков. Таким образом, только небольшая часть атомов каждого аминокислотного остатка в эпитопе может участвовать во взаимодействии V , . Эпитопы антигенов и паратопы антител являются взаимоопределяющимися сущностями, в силу их взаимной комплементарности. Созданы две взаимопротиворечащих модели механизма узнавания антигенантитело, это модель ключкзамку и модель индуцированного соответствия. В соответствии с первой оба партнера являются жесткими, недеформируемыми структурами и узнавание зависит от точной стерической и химической комплементарности . Альтернативная модель предполагает смещение группировок атомов обоих партнеров, позволяющее каждому адаптироваться к одной из нескольких конформаций другого партнера . Большинство кристаллографических работ, посвященных изучению комплексов антигенантитело, показывают наличие разной степени индуцированного соответствия, следовательно, модель ключкзамку менее пригодна для описания иммунохимических взаимодействий. Способность иммунной системы распознать антиген определяется как антителами, синтезируемыми Вклетками, так и Тклеточными рецепторами, узнающими антиген в процессированном виде. Иммуногенность белка, т. Тхелперных эпитопов, узнаваемых в контексте индивидуального набора МНС класса II молекул организмахозяина, и других регуляторных механизмов i, V , Роит и др. Поэтому участки белка, идентифицированные как эпитопы в одном иммунизированном хозяине, могут не проявлять антигенной реактивности и иммуногенности в другом. Кроме того, участки белковой молекулы могут не проявлять иммуногенности при иммунизации целым белком, но при этом могут являться эпитопами, которые узнаются антителами, индуцированными против соответствующих пептидных фрагментов I. Это обьясняется проявлением феномена иммунодоминантности, т. V , , . Получен ряд экспериментальных доказательств того, что основной вклад в создание иерархии иммунодоминантности эпитопов белкового антигена вносят лучшая доступность эпитопа для иммуноглобулиновых рецепторов Вклетки кинетическая селекция и аффинность взаимодействия термодинамическая селекция, а также конкуренция между активированными антигеном Вклетками за Тклеточную помощь . Vii . Повидимому, никакие уникальные физикохимические параметры не являются атрибутами эпитопов и необходимо определять их по самому важному функциональному свойству способности узнаваться специфическими иммуноглобулиновыми рецепторами Вклеток и антителами. Исторически Вэпитопы разделяют на категории, которые, часто нелегко отличить друг от друга экспериментально.