Изучение взаимодействия олиготуклеотидов и их производных с хроматином

• Автор: Боженок, Людмила Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 112 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ КАК РЕГУЛЯТОРЫ

ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Обзор литературы

1.1. РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ

1.1.1. Цисрегулирующие элементы транскрипции

1.1.2. Трансрегулирующие факторы транскрипции

1.2. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ И УЧАСТКОВ СВЯЗЫВАНИЯ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ

.1.Структурные особенности транскрипционных факторов

1.2.2. Особенности участков связывания транскрипционных факторов

1.2.2.1 .Промоторспсцифичные Факторы транскрипции

1.2.2.2.Энхансерспецифичные Факторы транскрипции

1.2.3. Регуляция экспрессии генов двуцепочечными олигонуклеотидами и их производными, несущими сайты связывания
транскрипционных факторов
1.3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ С ДНК В СОСТАВЕ ХРОМАТИНА
1.3.1. Структура хроматина
1.3.2. Особенности активного хроматина
1.3.3. Влияние структуры хроматина на связывание факторов транскрипции с ДНК
1.3.3.1. Влияние позиционирования нуклеосом
1.3.3.2. Влияние структуры нуклеосом
1.3.3.3. Структура ДНК в составе ДНКбелкового комплекса и се роль в активации транскрипции
1.4. ДРУГИЕ ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ТРАНСАКТИВАТОРОВ
1.4.1. Взаимодействие с другими белками хроматина
1.4.2. Влияние физических факторов
1.5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ С РНК
1.6. РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ ИНДУЦИБЕЛЬНОГО ГЕНА НА ПРИМЕРЕ ГЕНА ЧЕЛОВЕКА МОЮ
1.7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Список буферов и растворов
Реактивы и материалы
Основные методики
2.1. СИНТЕЗ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
2.1.1. Введение радиоактивной метки по 5концевому фосфату
2.1.2. Синтез алкилирующих производных олигонуклеотидов
2.1.3. Синтез фотоактивируемых производных олигонуклеотидов
2.2. АНАЛИЗ РЕАГЕНТОВ, ОЦЕНКА РЕАКЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ АЛКИЛИРУЮЩЕЙ ГРУППЫ В СОСТАВЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДА
2.3. КУЛЬ ТУРЫ КЛЕТОК
2.4. ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ ИЗ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР
2.4.1. Получение метафазных хромосом клеток линии Не Та БЗ
2.4.1.1. Синхронизация клеток
2.4.1.2. Выделение метафазных хромосом
2.4.2. Выделение ядер из клеток НеЬа
2.4.3. Выделение суммарного ядерного белка
2.4.4. Выделение ДНК
2.5. МОДИФИКАЦИЯ ХРОМА ТИНА РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
2.5.1. Модификация выделенных хромосом биотинилированным алкилирующим производным олигонуклеотида
2.5.2. Модификация хроматина клеток биотиншированными алкилирующими производными олигонуклеотидов
2.5.3. Модификация выделенных ядер алкилирующими производными олигонуклеотидов
2.5.4. Модификация выделенных ядер фотоактивируемыми производными олигонуклеотидов
2.5.5. Обработка ДНК хроматина ядер нуклеазой 7 перед стадиен модификации
2.5.6. Обработка препаратов клеток нуклеазой Б1
2.6. ДЕТЕКЦИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ КОМПОНЕНТОВ ХРОМАТИНА
2.6.1. Визуализация мест модификации выделенных хромосом под электронным микроскопом
2.6.2. Визуализация участков модификации хроматина клеток под люминесцентным флуоресцентным микроскопом
2.6.2.1. Синтез и выделение комплекса стрептавидин флуорсснеинизотноцианат гПТС
2.6.2.1. Визуализация участков модификации
2.6.3. Гельфильтрация
2.6.4. Электрофорез белков в градиентном геле
2.7. АФФИННАЯ СОРБЦИЯ ЯДЕРНЫХ БЕЛКОВ
3. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И
ИХ ПРОИЗВОДНЫХ С ХРОМАТИНОМ
Результаты и их обсуждение
3.1. ЛОКАЛИЗАЦИЯ РАСПЛЕТЕНЫХ ПОЛИ1АУЧАСТКОВ ДНК В СОСТАВЕ ИНТЕРФАЗНЫХ ЯДЕР И МЕТАФАЗНЫХ ХРОМОСОМ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ
3.2. ИЗУЧЕНИЕ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ ХРОМАТИНА В
УСЛОВИЯХ ПЕРЕХОДА ДНК ИЗ В в гКОНФОРМАЦИЮ
3.3. ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВОГО ОКРУЖЕНИЯ ДвТ,.ПОВТОРОВ В . ХРОМАТИНЕ МЕТОДАМИ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ И АФФИННОЙ СОРБЦИИ
ВЫВОДЫ
ПОСЛЕСЛОВИЕ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Анализ белков, модифицируемых в составе хроматина реакционноспособными производными олигонуклеотидов, дает сведения о белковом окружении расплетенных последовательностей ДНК в хроматине. Однако, для построения картины топографического расположения белков относительно расплетенного участка ДНК необходимо иметь данные о сродстве этих белков к модифицируемой последовательности. Такая информация может быть получена с помощью метода аффинной сорбции. Ранее в нашем институте был синтезирован ряд аффинных сорбентов, несущих иммобилизованные олигонуклеотиды, и показано, что белки, в частности, эндонуклеазы рестрикции, способны к специфичному связыванию с иммобилизованными на полимерах короткими олигонуклеотидами, содержащими сайты связывания этих ферментов . Это свидетельствует о возможности эффективного использования аффинных смол с иммобилизованными короткими олигонуклеотидами для выявления белков, имеющих сродство к определенной последовательности ДНК, и получения более детальной информации о топографии белкового окружения расплетенных участков ДНК в хроматине. Цслыо данной работы является локализация расплетенных одноцепочечных участков ДНК в хроматине и изучение белкового окружения расплетенных повторяющихся последовательностей с помощью реакционноспособных производных олигонуклеотидов и олигонуклеотидов, иммобилизованных на полимерах. Были поставлены следующие задачи. Разработка метода локализации расплетенных последовательностей ДНК в хроматине клеток млекопитающих, доступных для модификации производными олигонуклеотидов, направленными на эти последовательности, с помощью люминесцентной и электронной микроскопии. Изучение модификации хроматина клеток НеЬа вблизи сОТпповторов производными рбАСб, несущими на 5конце остаток 2хлорэтилариламина или нитроарилазида, в условиях, индуцирующих переход ДНК из В в 7форму. Изучение распределения в хроматине участков В7персхода ДНК и выявление вклада подобных переходов в появление одноцепочечных участков ДНК в хроматине. Изучение фотомодификации белков хроматина, входящих в окружение 1СТПповторов, параазидоанилидным производным рбАС. Выявление белков хроматина, потенциально способных к связыванию с 3ОТпблоками ДНК в хроматине, с помощью аффинной сорбции. Сравнение белков, имеющих сродство к бОТблокам, с белками, специфично модифицирующимися в окрестностях расплетенных участков 1СТпблоков. Проблема направленного воздействия на определенные гены является одной из наиболее актуальных проблем современной биологии. Ее решение позволило бы в некоторых случаях исправлять врожденные генетические дефекты, регулировать экспрессию отдельных генов и, как следствие, контролировать биохимические процессы на уровне клетки и целого организма. На сегодняшний день подходы к направленной регуляции экспрессии генов представлены различными методами изменения эффективности как грансляции определенных белков, например, с помощью антисмысловых РНК, так и регуляции транскрипции конкретных генов, например, путем подавления связывания регуляторных трансактивирующих факторов с участками узнавания на ДНК. Производные дезоксирибоолш онуклеогидов могут также являться перспективными инструментами для воздействия на определенные участки в хроматине. В работах нашей лаборатории была показана направленная модификация расплетенных одноцсиочечных участков повторяющихся последовательностей ДНК в хроматине с помощью реакционноспособных производных олигонуклеотидов 5. Известно, что процесс транскрипции является одной из причин возникновения в хроматине открытых расплетенных участков ДНК, которые модифицируются производными олигонуклеотидов. Транскрипционные факторы, принимающие участие в активации транскрипции данного гена, также могут модифицироваться этими производными, поэтому представляется интересным обобщить в данном литературном обзоре данные по факторам транскрипции, рассматривая их, с одной стороны, как белки, входящие в хроматин, и, с другой стороны, как регуляторы экспрессии генов. Транскрипция, наряду с процессами репликации и трансляции, представляет собой один из основных процессов матричного биосинтеза, осуществляемых живой клеткой.