Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию F-актина

• Автор: Пивоварова, Анастасия Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Актин

1.1. Строение вактина

1.2. Полимеризация актина

1.3. Рактин

1.4. Тепловая денатурация и агрегация актина

2. Малые белки теплового шока

2.1. Строение мономеров малых белков теплового шока

2.2. Сборка и структура олигомеров малых белков теплового шока
2.3. Фосфорилирование малых белков теплового шока
2.4. Шаперонная активность яНБР
3. Взаимодействие малых белков теплового шока с актином
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Препаративные методы
1.1. Выделение актина 4
1.1.1. Получение ацетонового порошка для выделения актина
из скелетных мышц кролика
1.1.2. Выделение актина из ацетонового порошка
1.2. Определение концентрации белков
1.3. Полимеризация актина
2. Используемые методы исследовании
2.1. Исследования термодинамических характеристик тепловой денатурации белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии ДСК
2.2. Исследование агрегации Бактина методом светорассеяния
2.3. Исследование белков и их комплексов методом
скоростной седиментации
2.4. Динамическое лазерное светорасссяение ДЛС
2.5. Определение вязкости растворов
2.6. Аналитическое соосаждение
2.7. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии БОБ
2.8. Гельфильтрация
. 2.9. Метод флуоресцентной спектроскопии
2 Электронная микроскопия
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Исследование процессов тепловой денатурации Кактнна
и малых белков теплового шока
1.1. Денатурация Еактина в условиях теплового шока при С
1.2. Калориметрические исследования малых белков теплового шока
1.3. Исследование влияния малых белков теплового шока
на денатурацию Гактина методом ДСК
2. Влияние малых белков теплового шока на агрегацию Кактина, вызываемую нагреванием
2.1. Исследование шаиеронных свойств эНБР методом светорассеяния
2.2. Исследование влияния малых белков теплового шока
на агрегацию Еактина с использованием флуоресцентных меток
2.3. Исследование взаимодействия вНБР с Бактииом при разных температурах методом соосаждения
3. Изучение характеристик растворимых комплексов, образуемых
малыми белками теплового шока с денатурированным актином
3.1. Исследование комплексов, образуемых зр с денатурированным актином, методом динамического светорассеяния
3.2. Исследование растворимых комплексов, образуемых Шр с денатурированным актином, методом аналитического ультрацентрифугирования
3.3. Определение стехиометрии комплексов, образуемых Н.чрЗЭ с денатурированным актином, с использованием метода гельфильтрации
4. Сравнение свойств комплексов, образуемых денатурированным актином
с НрЗП и с ЬрУ
4.1. Сравнение с использованием метода ДДС
4.2. Сравнение с использованием метода аналитического ультрацеитрифугировання
4.3. Электронные микрофотографии комплексов Няр и Нриа
с денатурированным актином
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


При помощи этого подхода показано, что малые белки теплового шока эффективно предотвращают агрегацию актина, вызываемую его тепловой денатурацией, но при этом не оказывают заметного влияния на сам процесс денатурации белка. , а именно выяснить, что они влияют лишь на тепловую агрегацию белка, но не препятствуют тепловой денатурации белка, предшествующей агрегации. Методом соосаждения показано, что малые белки теплового шока связываются с актином лишь в процессе его тепловой денатурации, защищая актин от агрегации, но не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами. Установлено, что защита актина от агрегации осуществляется путем образования небольших, стабильных и хорошо растворимых комплексов с денатурированным актином. При совместном использовании методов ДСК, динамического лазерного светорассеяния ДЛС, ссдиментационного и флуоресцентного анализа проведены исследования свойств таких комплексов. Показано, что размеры этих комплексов снижаются с повышением концентрации . В условиях насыщения, которое наступает при приблизительно эквимолярных исходных концентрациях и актина, гидродинамический радиус таких комплексов равен нм, коэффициент седиментации , а их молекулярная масса составляет около кДа. Показано, что изменение исходного олигомерного состояния , вызываемое, в частности, фосфорилированием этих белков или его имитацией, не оказывает существенного влияния на способность I образовывать небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином. Полученные данные впервые позволяют описать механизм защиты актинового цитоскелста от аморфной агрегации, приводящей к гибели клеток при различных неблагоприятных воздействиях. Полученные данные расширяют и углубляют знания в области механизма, лежащего в основе шаперонной активности , и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии. Разработанный нами экспериментальный подходпараллельное исследование тепловой денатурации и агрегации актина, проводимое в одинаковых условиях и при одной и той же скорости прогрева в отсутствие и в присутствии , может использоваться и уже успешно используется для изучения взаимодействия с другими белкамимишенями. Актин, один из основных белков сократительного аппарата мышц, является также основой структуры мнкрофиламснтов тонких нитей цитоскелста эукариотических клеток, где его содержание очень высоко может достигать 2,5 мгмл. Впервые актин был открыт Штраубом в г. , как белок мышц, активирующий АТФазу миозина, что и определило его название. В настоящее время установлено, что актин является структурным белком любых клеток эукариот более того, недавно в бактериях были найдены белки, гомологичные актину РагМ и МгсВ. С актиновыми езруктурами цитоскелста связаны поддержание формы, движение и деление клеток, эндо и экзоцитоз, передача медиаторов, свертывание крови, а также процессы, происходящие при дифференцировкс клеток , . . Предполагается участие актннового цитоскелста в регуляции активности ионных каналов, передаче внутриклеточного сигнала в ядро, транспорте мРНК и транскрипции i . I. , i Vi, . Важнейшей особенностью актина, определяющей его исключительное физиологическое значение, является способность к обратимой трансформации из глобулярного состояния актин в полимер актин. В отличие от стабильных актнновых нитей сократительного аппарата мышц, микрофиламенты цитоскелета способны динамически собираться и разбираться в зависимости от потребностей клетки. Нарушение процессоп полимеризации и деполимеризации актиповых филаментов может привести к нарушению жизнедеятельности клетки. Актины образуют семейство белков, кодируемых отдельными генами. В клетках позвоночных синтезируется несколько изоформ актина, которые экспрессируются в разных тканях или на разных стадиях развития аизофор. Хайтлина, . Молекула актина скелетных и сердечных мышц имеет молекулярную массу кДа, размер 5,5 х 5,5 х 3,5 нм и кислую изоэлектрическую точку 5,45,5.