Биохимические аспекты ДНК-деструктивного действия повышенного давления кислорода

• Автор: Водолажский, Дмитрий Игоревич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Ростов-на-Дону
• Количество страниц: 133 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

1. Обзор литературы

1.1. Общие сведения о токсичности кислорода

1.2. Химические свойства кислорода

1.3. Свойства активных форм кислорода.

1.3.1. Супероксидный анион радикал О2

1.3.2. Гидроксильный радикал ОН.

1.3.3. Перекись водорода Н2О2.

1.3.4 Синглегный кислород О2 .

1.4. Внутриклеточные генераторы активных форм кислорода.

1.4.1. Ксантиноксидаза.

1.4.2. Митохондрии и эндоплазматический ретикулум.
1.4.3. Роль железозависимых процессов в генерации АФК
1.5. Повреждение ДНК активными формами кислорода
1.6. Общие представления о влиянии ведущих факторов гипербароксигенации на организм животных и человека
1.6.1. Метаболические перестройки при гипероксических воздействиях
1.6.2. Цитогенетические эффекты ГБО.
1.7. Механизмы защиты от токсического действия кислорода
1.7.1. Супсроксиддисмутаза
1.7.2. Каталаза.
1.7.3. Пероксидазы
1.7.4. Неферментативные реакции.
1.7.4.1. Глутатион
1.7.4.2. Токоферол витамин Е
1.7.4.3. Аскорбиновая кислота витамин С.
1.7.4.4. Вторая линия защиты клеток от АФК
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Постановка и задачи экспериментов
2.2. Материалы и методы.
2.2.1. Единицы измерения повышенного давления кислорода
2.2.2. Питательные среды, использованные в работе
2.2.3.1. Определение концентрации белка по Лоури
2.2.3.2. Определение концентрации белка по Эресману
2.2.4. Определение однонитевых разрывов ДНК
2.2.5. Определение деградации нуклеиновых кислот в условиях генерации супероксиданиона.
2.2.5.1. Определение деградации нуклеиновых кислот после инкубации в условиях генерации активных форм кислорода.
2.2.6. Определение г енерации гидроксильных радикалов
2.2.7. Препаративное выделение ядерной фракции клеток
2.2.8. Определение суммарной ДНКазной активности
2.2.9. Определение фрагментации ДНК по показателю увеличения фракции ПДИ полидезоксинуклеопротеиды.
2.2 Методика выделения лейкоцитов
2.2 Выделение мононуклеарных клеток из крови и костного мозга
2.2 Подсчт количества живых и мртвых клеток
2.2 Определение степени деградации ДНК.
2.2 Количественное определение ДНК с помощью диаминобензойной кислоты x
2.2 Источники биологических образцов для анализа
2.2 Статистическая обработка данных
2.3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.3.1. Однонитевые разрывы в ДНК, индуцированные повышенным давлением кислорода.
2.3.2. Определение двунитевых разрывов хроматина лимфоидных органов после обработки животных повышенным давлением кислорода i viv по показателям увеличения ПДИ
2.3.3. Изменение суммарной ДНК азной активности после ГБО воздействия
2.3.3.1. ДНК азная активность в лейкоцитах.
2.3.3.2. Суммарная ДНК азная активность в спленоцитах экзогенная ДНК
2.3.3.3. Суммарная ДНКазная активность плазмы периферической крови крыс после ГБОвоздействия в дозе 0,5 МПа минут
2.3.4. Суммарная ДНКазная активность в ядрах клеток тканей крыс после ГБОвоздействия
2.3.4.1. Суммарная ДНКазная активность в ядерной фракции лейкоцитов после воздействия повышенного давления кислорода.
2.3.4.2. ДНКазная щелочная активность в ядерной фракции спленоцитов после воздействия повышенного давления кислорода.
2.3.5. 2V2 зависимая ДНК азная активность после ГБОвоздействия
2.3.5.1. 2 зависимая ДНК азная активность в лейкоцитах после ГБОвоздействия
2.3.5.2. Плазма периферической крови.
2.3.5.3. зависимая ДНК азная активность в спленоцигах
2.3.6. Действие кислорода под давлением на лимфоциты человека в модельных условиях.
2.3.7. Индукция генерации гидроксильных радикалов повышенным давлением чистого кислорода и температурным шоком при действии на изолированные лимфоциты периферической крови человека
2.3.8. Влияние кратковременного нагревания температурный шок на генерацию гидроксильных радикалов в суспензии лимфоцитов и контрольном растворе
2.3.9. Действие температурного шока на индукцию однонитевых разрывов ДНК лимфоцитов периферической крови человека в условиях i vi.
2.3 Влияние топологической организации нуклеиновых кислот на их
устойчивость к повреждению активными формами кислорода.
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Таблица 1.1.
Таблица 2.
Таблица 2.
Таблица 3.
Таблица 3.
Таблица 3.3.
Таблица 3.
Таблица 3.5.
Таблица 4.1.
Таблица 4.2.
Таблица 5.1.
Таблица 5.2.
Таблица 5.3.
Таблица 6.
Таблица 7.1.
Таблица 8.2.
Таблица X 9.
Таблица .1.
Таблица Ху .2.
Таблица Ху .3.
Таблица Ху .4.
Таблица Ху .5.
Таблица Ху .6.
Таблицах .7.
Список основной использованной литературы


Определить уровни ДНКазной активности щелочной и 2зависимой в различных тканях экспериментальных животных после ГБО воздействия. Дать характеристику повреждению ДНК лимфоцитов при ГБОвоздействии i vi по показателю ОР ДНК. Дать количественную оценку деградации препаратов нуклеиновых кислот хромосомная ДНК, суммарная РНК, ковалентнозамкнутая кольцевая форма плазмиды 2 в условиях обработки кислородом при повышенном давлении в модельных условиях, а также с химическими генераторами активных форм кислорода. Повышенное давление кислорода 0,5 МПа минут экспозиции и 0,7 МПа, минут экспозиции индуцирует ОР ДНК лейкоцитов периферической крови, костного мозга и в спленонитах крыс. В ткани тестикул указанные режимы ГБОвоздействия не индуцировали ОР ДНК. ГБОобработка вызывает эффективную индукцию двунитевых разрывов в ДНК экспериментальных животных, оцениваемую по приросту фракции ПДН. Процесс фрагментации хромосомной ДНК имеет сложный временной профиль первый пик повреждений после окончания воздействия сменяется фазой репарации и следующей за ней более выраженной фазой развития повреждений ДНК через 5 часов и более. Одним из механизмов деградации ДНК после ГБОвоздействия служит индукция щелочных ДНКаз в исследованных тканях. ГБО в условиях i vi в использованных нами дозах и экспозициях не способна вызывать столь же эффективное разрушение препаратов нуклеиновых кислот, как в условиях i viv. Активные формы кислорода способны разрушать препараты нуклеиновых кислот в присутствии ионов металлов переменной валентности в частности, i. По степени устойчивости к повреждающему действию АФК нуклеиновые кислоты в нисходящем порядке располагаются следующим образом суперспиральная ДНК, суммарная хромосомная ДНК и РНК. Главным прогрессом последних лет было осознание того факта, что повреждения ДИК и мутации являются результатом воздействия, главным образом, эндогенных продуктов клеточного метаболизма МатеИ. ЛФК, возникающие в процессе восстановления Ог, могут атаковать азотистые основания ДНК или дезоксирибонуклеотидный остов, вызывая модификации оснований или разрывы нитей ДНК V Щ а1. АФК могут окислять липиды или молекулы белков, вызывая образование промежуточных продуктов, которые реагируют с ДНК, формируя аддукты ГегЬаиег Щ а1. Последующая репликация этих поврежденнныхмодифицированных участков приводит к мутациям или апоптозу 1оЬпоп е а. Атмосфера планеты Земля была анаэробной до появления фотосинтеза, вызывающего фотолиз воды с образованием молекулярного Ог. Накопление Ог изменило условия эволюционного отбора для всех организмов. Это также увеличило частоту мутаций и поэтому ускорило последующее развитие всех форм жизни. Благодаря использованию О2 были получены дополнительные преимущества путем увеличения полезной энергии, получаемой при утилизации пищевых продуктов, появилась способность выполнять новые метаболические преобразования и даже производить высокую температуру возможность терморегуляции и свет Рпсктсй, . Но за эти выгоды необходимо было заплатить определенную цену необходимо было создать защитные системы против высокой потенциальной токсичности этого парамагнитного газа. Те организмы, которые следовали по пути развития необходимых для этого защитных систем, могли пожинать выгоды, и они вызвали огромное разнообразие аэробных форм жизни, которые являются теперь преобладающими на Земле. Тс же, что не смогли приспособиться к токсичности О2, развились в анаэробные формы жизни, в настоящее время ограниченные теми анаэробными нишами, которые остаются даже на полностью аэробной планете. Приобретенная в процессе эволюции способность живых систем использовать кислород явилась одной из самых удачных находок природы, обусловивших, однако, неизбежность образования в тканях оксигенных радикалов. Являясь значительно более реакционноспособными формами, чем обычный молекулярный кислород, радикальные продукты превращения кислорода быстро вступают во взаимодействие со многими органическими и неорганическими соединениями, играющими во многих случаях ключевую роль в процессах клеточного метаболизма.