Активность ДНК-метилаз этиолированных проростков пшеницы

• Автор: Кавальская, Виктория Степановна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Киев
• Количество страниц: 116 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ б

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. с,

ГЛАВА I. ПРИРОДА И ПРОИСХОВДЕНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ МЕТИЛИРОВАННЫХ ОСНОВАНИЙ В ДНК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

1. Метилированные основания в ДНК и механизм

их возникновения .

2. Органоидная специфичность и внутригеном

ное распределение хлС II

ГЛАВА П. СОДЕРЖАНИЕ 5МЕТМЛЦИТОЗИНА В ДНК ВЫСШИХ

РАСТЕНИЙ.

1. Видовая специфичность .

2. Тканевая клеточная специфичность метилирования ДНК
3. Изменение метилирования ДНК в онтогенезе
4. Влияние фитогормонов и других факторов на
изменение содержания 5метилцитозина в ДНК
ГЛАВА I. МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК У РАСТЕНИЙ
1. Синтез ДНК и ее метилирование i viv
2. Особенности метилирования ДНК i vi
3. ДНКметилазы эукариот и их свойства . .
ГЛАВА 1У. ВОЗМОЖНАЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ
ДНК У ЭУКАРИОТ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
I. Материалы и объекты исследований .
2. Методы исследований .
1. Проращивание семян пшеницы
2. Введение радиоактивной метки в ДНК проростков
а Контроль за синтезом новообразованной ДНК
с помощью тимидина.
б Исследование степени метилирования вновь синтезируемых ДНК в присутствии 2С
оротовой кислоты и 8С аденина . .
3. Выделение ДНК .
а Модифицированный метод Марьура .
б Вццеление и очистка из замороженных проростков высокомолекулярной ядерной ДНК центрифугированием в градиенте плотности С зС1
в Выделение ДНК из замороженных жидким азотом
проростков пшеницы
4. Подготовка препаратов ДНК для анализа нуклеотидного состава.
5. Определение нуклеотидного состава и уровня метилирования ДНК
а Гидролиз суммарной ДНК
б Подготовка целлюлозы и пластинок .
в Хроматография оснований
6. Получение бесклеточного экстракта с ДНКмети
лазной активностью
а Осаждение нуклеиновых кислот сульфатом
стрептомицина .
б Фракционирование белков бесклеточного экстракта сульфатом аммония
в Гельфильтрация материала на Сефадексе
грубый.
г Проведение реакции метилирования i vi
7. Выделение хроматина из этиолированных проростков пшеницы
Прочие методы
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА I. ОБНАРУЖЕНИЕ ДНКМЕТИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В
БЕСКЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТАХ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ
1. Особенности метода определения ДНКметилазной активности i vi
2. Получение бесклеточного экстракта из 3х суточных этиолированных проростков пшеницы
ГЛАВА П. СВОЙСТВА ЦИТИН0В0Й ДНКМЕТИЛАЗЫ ИЗ ЛИСТЬЕВ
3Х СУТОЧНЫХ ЭТИОЛИРОВАННЫХ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ
ГЛАВА Ш. СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДНКМЕТИЛАЗЫ ИЗ
ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ
ГЛАВА 1У. ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЦИТИН0В0Й ДНКМЕТИЛАЗЫ
ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ В КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ
ГЛАВА У. и6 ЬЕТИЛАДЕНИН В ДНК ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ
1. Включение 8 С аденина и метилирование адениновых остатков в ДНК первого листа проростков пшеницы .
2. Адениновая ДНКметилазная активность в первом листе этиолированных проростков пшеницы .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


У растений существует репликативное и пострепликативное метилирование ДНК Башките и др. ДНКРепликативное метилирование ДНК является ведущим элементом регуляции сшепени метилирования ДНК в клетке. Практически ничего неизвестно, как метилируется ДНК в клеточном цикле у растений, какие и сколько ДНКыетилэз функционируют при этом, каковы свойства этих ферментов и узнаваемые ими нуклеотидные последовательности ДНК. Изучение этих моментов, на нет взгляд, имеет принципиальное значение, так как с одной стороны, позволит вплотную приблизиться к объяснению механизмов модификации генома растений и регуляции его активности при дифференцировке клеток, а с другой стороны, оно исключительно важно для выяснения биологической роли метилирования ДНК у высших растений. Основной целью настоящей работы является выделение и исследование свойств ДНКметилаз из развивающихся этиолированных проростков пшеницы. Выяснить, содержится ли в ДНК пшеницы иметиладенин и присутствуют ли в бесклеточных экстрактах этиолированных проростков пшеницы адениновые ДНКметилазы. В результате проведенных исследований в проростках пшеницы найденэ ДНКметилаза, способная переносить СН3группы с эаденозилметионинз на цитозиновые остатки ДНК с образованием остатков 5метилцитозинз. Показано, что цитозиновая ДНКметилаза пшеницы способна метилировать эндогенную и экзогенную гомологичные ДНК. Бактериальные ДНК из клеток i ii метилируются в этих же условиях значительно хуже Впервые установлено, что в процессе развития первого листа этиолированных проростков пшеницы в клетках меристемы изменяется цитозиновая ДНКметилазная активность, коррелирующая с интенсивностью синтеза ДНК. В ДНК проростков пшеницы впервые найден к метиладенин в качестве дополнительного минорного основания 0,2 от включенного в ДНК меченого аденина. В бесклеточных экстрактах из проростков пшеницы впервые обнаружена адениновая ДНКметилазная активность, осуществляющая i vi перенос метальных групп с аденозил метионина на адениновые остатки гомологичной и бактериальной ДНК. Выполненная работа носит теоретический характер. Полученные данные могут быть использованы при чтении курсов лекций и проведении практикумов по физиологии и биохимии растений и молекулярной биологии. Экспертаментальные результаты вносят вклад в понимание механизмов энзиматической модификации генома растений и регуляции его активности при дифференцировке клеток, полученные результаты могут быть использованы для разработки методов целенаправленного изучения ДНКметилаз, в частности, для изучения существования рестрикции у растений и влияния зависимости матричной активности ДНК и экспрессии генов от степени и характера ее метилирования. Настоящее исследование выполнено в Межфакультетской проблемной лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и на кафедре общей и молекулярной генетики Киевского государственного университета им. Т.Г. Шевченко. ГЛАВА I. ДНК разного происхождения наряду с обычными могут встречаться дополнительные метилированные основания , . В ДНК высших растений уже давно выявлен 5ыетилцитозин т С и он обнаруживается в суммарных ДНК всех изученных до сих пор высших растений Ванюшин,, , , . i, , , , . При инкубации проростков пшеницы с мечеными по ыетильной группе с и его нуклеозидами заметной активности в выделенном из ДНК 5С не обнаружено Хвойка и др. I4 Суликаова и др. Сделан вывод, что С и его нуклеозиды не могут включаться в ДНК в готовом виде, а весь обнаруживаемый в ДНК растений С, повидимому, является продуктом энзиматического метилирования цитозиновых остатков в цепях ДНК. Количество 5С варьирует в ДНК разных видов растений от I до Ю мпЛо Ванюшин, , , , . Для исследования специфичности метилирование генома высших растений особый интерес приобретают поиски в их ДНК других оснований, и в частности, нметиладенина т А. Эю основание обычно для ДНК бактерий Ванюшин, а, грибов .