β-ксилозидаза из Aspergillus awamori: свойства и использование в ферментативном синтезе

• Автор: Энейская, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Гатчина
• Количество страниц: 107 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Основные положения, выносимые на защиту

1.4. Научная новизна полученных результатов

1.5. Теоретическое и практическое значение работы

1.6. Апробация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Гликозидгидролазы, механизм действия

2.2. Ксилаиы природные субстраты ксилозидаз

2.3. Ксилозидазы микроорганизмов, физикохимические характеристики

2.4. Структурнофункциональные исследования ксилозидаз
2.5. Трансгликозилирование, ферментативный синтез гликоконыогатов
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Субстраты для измерения ферментативной активности
3.2. Методы измерения ферментативной активности
3.3. Выделение ксилозидазы из мицелиального гриба i i
3.4. Выделение ксиланазы из мицелиального гриба i i семейство
3.5. Выделение ксиланазы из мицелиального гриба i
i семейство
3.6. Методы определение чистоты и молекулярной массы ферментов
3.7. Методы определения частичной аминокислотной последовательности Рксилозидазы
3.8. Методы исследования физикохимических свойств Рксилозидазы
3.9. Методы определения кинетических характеристик и констант ингибирования реакций гидролиза, катализируемых ферментами
3 Определение стереохимии ферментативного гидролиза рксилозидазы методом Н ЯМР спектроскопии
3 Исследование трансгликозилирующей активности Рксилозидазы
3 Исследование влияния и концентрации яНФК и МУФК2 на выход продуктов трансгликозилирования
3. Препаративный синтез лНФК2.3 иМУФК3.
3 Препаративный синтез яНФК4.
3 Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования методом ЯМР
3 Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования методом массспектрометрии
3 Исследование характера действия ксиланаз семейств и по отношению к ферментативно синтезированным лНФК2.6 и МУФК2.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Выделение и физикохимические свойства рксилозидазы из мицелиального гриба i i
4.2. Исследование первичной структуры рксилозидазы 4.3.0пределение констант ионизации каталитических групп рксилозидазы
4.4. Исследование стереохимии гидролиза и характера действия р ксилозидазы
4.5. Исследование трансгликозилирующей активности Р ксилозидазы
4.6. Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования методами ЯМР и массспектрометрии
4.7. Анализ кинетических характеристик реакции гидролиза, катализируемой рксилозидазой
4.8. Анализ констант ингибирования реакции гидролиза, катализируемой Рксилозидазой
4.9. Исследование продуктов реакции трансгликозилирования, катализируемой изучаемой Рксилозидазой из мицелиального гриба i i, в качестве субстратов для эндоксиланаз семейств и
5. ВЫВОДЫ
6. Список опубликованных по теме работ
7. БЛАГОДАРНОСТИ
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
вэжх Высокоэффективная жидкостная хроматография
ВП МС Времяпролетная массспектрометрия
ДМФА Диметилформамид
ДСН Додецил сульфат натрия
сд. Единицы
К.Ф. Комиссия по ферментам
КОС Ксилоолигосахариды
МС Массспектрометрия
МСМС Двумерная массспектрометрия
МУФ 4Метилумбеллиферил
МУФК 4Метилумбеллиферилр0ксилопиранозид
и.о. Не определено
лНФАра шяНитрофенолаЬарабинопиранозид
яНФК шюНитрофенилрОксилопиранозид
с.п. Степень полимеризации
тех Тонкослойная хроматография
ТФУ Трифторуксусная кислота
ЭДТА Этилендиаминтетрауксусная кислота
ЯМР Ядерный магнитный резонанс
АБр Аспарагиновая кислота
Корреляционная спектроскопия
Глутаминовая кислота
Гетероядерная многоквантовая корреляционная
спектроскопия Км Константа Михаэлиса
Ккйт Константа скорости, каталитическая
Кн Константа ингибирования
Ядерный эффект Оверхаузера
i Изоэлектрическая точка
Часть на миллион
ВВЕДЕНИЕ


Препаративный синтез лНФК2. МУФК3. Препаративный синтез яНФК4. Исследование характера действия ксиланаз семейств и по отношению к ферментативно синтезированным лНФК2. МУФК2. Исследование первичной структуры рксилозидазы 4. К.Ф. Углеводы играют существенную роль в мириадах биологических процессов. Огромное количество различных олигосахаридных структур, обнаруженных в природе, происходит из рациональной организации ферментативного образования и разрыва гликозидных связей. Гликозидная связь является одной из наиболее прочных связей, существующих в природе. Период ее естественного распада составляет более 5 миллионов лет. Гликозидгидролазы ферменты, способные ускорить гидролиз гликозидной связи более чем в раз, являются одними из наиболее эффективных из существующих катализаторов. Поэтому интерес к реакциям ферментативного гидролиза природных полимеров обусловлен не только фундаментальными, но и прикладными задачами. Ксилан основной структурный полисахарид клеток растений, зторой по распространенности после целлюлозы полисахарид в природе. Ксилан представляет собой полимер, состоящий, в основном, из цепей ЗЭксилопиранозных остатков, соединенных гликозидными связями Основными компонентами ксиланолитической системы, определяющими скорость гидролиза ксилана, являются два типа ферментов эндоксиланазы 1,4РОксиланогидролазы К. Ф. 3. К.Ф. Огромный интерес к изучению системы ферментов, участвующих в метаболизме этого полимера, связан с их широким применением в биотехнологии. Эти ферменты используют в целлюлознобумажной, текстильной и пищевой промышленности . Интенсивное использование эндоксиланаз и ксилозидаз в промышленном производстве постоянно стимулирует два основных направления исследований поиск новых источников ферментов и подробное изучение их ферментативных свойств, дающее возможность более эффективно использовать данные ферменты в биотехнологических процессах. Второе направление возможного использования гликозидгидролаз в биотехнологии основывается на том факте, что многие представители этого класса ферментов обладают не только гидролитической, но и трансгликозилирующей синтазной активностью, и способны осуществлять ферментативный синтез различных гликоконыогатов. Одним из примеров применения трансгликозилирующей активности гликозидгидролаз является ферментативный синтез олигосахаридов, содержащих хромофорные или флуоресцентные группы . Гликозидгидролазы являются эффективным инструментом в синтезе подобных олигосахаридов благодаря их высокой селективности и стереоспецифичности. Такого рода субстраты используются для исследований широкого круга гликаназ .