Характеристика нового семейства сайт-специфических эндонуклеаз, кодируемых Т5-подобными бактериофагами

• Автор: Акуленко, Наталья Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 117 с. : ил.

Содержание

Список сокращений.

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Хоумингэидонуклеазы

1.2. эндонуклеазы

1.3. Каталитический центр эндонуклеаз

1.3.1. Структура каталитического центра эндонуклеаз.

1.3.2. Роль иона металла в структуре активного

центра эндонуклеаз.

1.3.3. Единство структурной и функциональной организации

каталитического центра нуклеаз суперсемейства .
1.3.4. Модель катализа гидролиза ДНК эндонуклеазами семейства .
1.4. Генетическая роль эндонуклеаз.
1.5. Узнавание ДНКсубстратов хоумингэндонуклеазами.
1.5.1. Специфическое узнавание последовательности
ДНК сайтспецифическими эндонуклеазами.
1.5.2. Взаимодействие эндонуклеазы I с сайтом узнавания
1.5.3. Взаимодействие эндонуклеазы с сайтом узнавания
1.5.4. Взаимодействие эндонуклеазы I7vI с сайтом узнавания
1.5.5. Взаимодействие эндонуклеазы с сайтом узнавания
2. Материалы и методы
2.1. Плазмиды
2.2. Штаммы бактерий и бактериофагов.
2.3. Базовые методы молекулярной биологии и биохимии.
2.4. ДНКсубстраты
2.5. Получение матричной ДНК для транскрипции i vi
2.6. Транскрипция i vi
2.7. Синтез белка в бссклеточной системе трансляции
из зародышей пшеницы.
2.8. Анализ нуклеазной активности.
2.9. Картирование точек разрыва ДНК.
2 Экспрессия и очистка эндонуклеаз 77I и .
2 Картирование сайта узнавания эндонуклеазы 71.
21. Защита ДНК белком от воздействия ДНКазы I,
гидроксильных радикалов и димстилсульфата
21.1. Защита от ДНКазы 1.
21.2. Защита от гидроксильных радикалов
21.3. Защита от диметилсульфата
22. Эксперименты с использованием модифицированных ДНКсубстратов метилированных, этилированных
или с удаленным нуклеозидом.
23. Секвенирование ДНКсубстрата по МаксамуГилберту
24. Анализ расщепленных фрагментов ДНК
25. Количественная обработка результатов
2 Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей
2 Олигонуклеотиды.
3. Результаты
3.1. В области генов тРНК бактериофагов Т5 и ii i, а также бактериофага 5 i v. i обнаружены ОРС, кодирующие
предполагаемые НЫНэндонуклеазы.
3.2. Гены , , и кодируют
сайтспецифические эндонуклеазы.
3.3. Выявление дополнительных сайтов гидролиза
эндонуклеаз РЩ, РЩ1 и РТуЛН
3.4. Разработана схема выделения и очистки
эндонуклеаз ТИ и ТТИ1
3.5. Эндонуклеазы Ии наиболее активны
при экстремальных значениях и температуры
3.6. Активность эндонуклеаз Т1 и Р7УШ стимулируется
широким рядом ионов двухвалентных металлов
3.7. Ион 2 повидимому, стабилизирует структуру
изучаемых нуклеаз.
3.8. Эндонуклеаза Р71 специфично связывается с двумя участками ДНК, расположенными на
противоположных концах сайта узнавания.
3.8.1. Эндонуклеаза ТЛ1 связывает протяженный участок ДНК
3.8.2. Контакты эндонуклеазы ГТ1 с остовом ДНК
распределены по всему сайту узнавания.
3.8.3. Контакты эндонуклеазы с основаниями
расположены в двух участках сайта узнавания.
3.8.4. Эндонуклеаза ТИ1 контактирует с основаниями сайта
узнавания в основном со стороны большого желобка ДНК
3.8.5. Контакты с остатками фосфатов остова ДНК не существенны
для образования комплекса Р77ПДНК
4. Обсуждение.
Список цитируемой литературы


Т5 9 из 2 номер в базах данных . Следует отметить, что эти нуклеазы, как правило, сосредоточены у одного из фагов, тогда как большая их часть отсутствует у других близкородственных фагов. Например, охарактеризованные эндонуклеазы I7vI, I7vII . . . i . 4, отсутствуют у фага Т2, а из обнаруженных в данной работе эндонуклеаз 77I, 77II, 77III и 77IV, кодируемых фагом Т5, только одна 7IV присутствует в геноме близкородственного фага Ксензенко и др. Следует также отметить, что большинство известных хоумингэндонуклеаз, кодируемых бактериофагами, имеют внеинтроиную локализацию только 2 из указанных нуклеаз фага Т4 кодируются нитронами i . II или . Учитывая информационную насыщенность фаговых геномов, такое изобилие хоумингнуклеаз в сочетании с их неравномерным распределением среди близкородственных фагов, представляется неслучайным и возникает вопрос о функциональной роли этих ферментов. Известно, что эндонуклеазы , и семейство II, имеющие внеинтронную локализацию, способны инициировать процесс генной конверсии, аналогичный хоумингу v . . i . В то же время, они, в отличие от большинства других хоумингэндонуклеаз, разрезают как ДНК своего фага, так и чужого. Это обстоятельство позволяет предположить возможность участия этих ферментов также в других рекомбинационных событиях. Представляет также интерес изучение генетической роли эндонуклеазы IНти и ряда ее гомологов 1Яты, и , вносящих одноцепочечные разрывы в ДНК iIi , . . Известно, что эндонуклеазы и IЯтиИ инициируют процесс хоуминга . Механизм инициации этого процесса на молекулярном уровне еще предстоит раскрыть, поскольку до сих пор полагали, что перенос интронов инициируется внесением только двуцепочечных разрывов в ДНК, репарация которых и лежит в основе хоуминга. Структурная организация, а также узнающие свойства эндонуклеаз семейств II и намного менее изучены, чем у представителей семейства хоуминг3iiii3I. Эндонуклеазы v семейство II и IНти единственные представители указанных семейств с известной структурой комплексов белокДНК V . . В составе этих комплексов указанные нуклеазы обладают удивительно вытянутой структурой с множеством четко отделенных друт от друга ДНКсвязывающих доменов и мотивов. Таким образом, эти ферменты, в отличие от таких глобулярных белков, как эндонуклеазы рестрикции и хоумингэндонуклеазы семейств I и i x, являются удобным объектом для изучения механизмов белокнуклеиновых взаимодействий, а также для конструирования ферментов с заданной специфичностью. Следует отметить, что изучение структур эндонуклеаз I7vI и Нти позволило выявить новые компактные ДНКсвязывающие домены. Кроме того, оказалось, что известные ранее ДНКсвязывающие домены в этих белках обладают совершенно другими узнающими свойствами. В связи с этим изучение ферментов подобных эндонуклеазам IvI и 1ЯшЛ, несомненно, представляет большой интерес с точки зрения выявления в них новых ДНКсвязывающих доменов, а также характеристики их структурных и узнающих свойств. Цель и задачи паПоты. Основной целью данной работы являлось разностороннее изучение четырех гомологичных нуклеаз, кодируемых Т5подобными фагами. Доказательство функциональной активности четырех предполагаемых эндонуклеаз. Картирование точек разрывов, вносимых в ДНК, эндонуклеазами , 77II, и 77IV. Разработка схемы очистки и выделения эндонуклеаз 77I и 77II. Биохимическая характеристика эндонуклеаз II и 7II. Картирование сайта узнавания эндонуклеазы III. Научная новизна. В результате данной работы были впервые охарактеризованы четыре гомологичные сайтспецифические эндонуклеазы, гены которых расположены вне нитронов.