Роль мажорного белка мРНП р50 в регуляции трансляции, обеспечении стабильности и локализации мРНК в клетках эукариот

• Автор: Рузанов, Пётр Владиславович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино-на-Оке
• Количество страниц: 140 с.

1. Роль мажорных белков в структурной организации мРНП

1.1. РАВР и его роль в структурной организации мРН 1

1.3. Структурные и функциональные свойства р и родственных белков.

1.4. р как структурный белок мРНП

2. Роль РАВР и р в регуляции трансляции.

2.1. РАВР как неканонический фактор инициации трансляции

2.2. р и родственные УЪ белки как репрессоры трансляции

2.3. р как неканонический фактор инициации трансляции.

2.4. Возможная модель участия РАВР и р в регуляции трансляции мРНК

3. Механизмы обеспечения стабильности мРНК в клетках эукариот.

3.1. ПолиАхвост и РАВР обдне детерминанты стабильности мРНК.

3.2. Специфические регуляторные белки и детерминанты стабильности мРНК
3.3. белки ключевой компонент системы маскирования мРНК в клетке.
4. Трансляция и цггоскелст.
Заключение и перспективы
Материалы и Методы
1. Получение плазмндиых конструкций.I.
2. Получение препаратов белков и антител .V.
3. Выделение плазмидной ДНК
4. Выделение суммарных мРНП из клеток
5. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии
6. Иммунологический анализ белковых препаратов блог анализ
7. Пришивка антител к белок АСсфарозс
8. Синтез и радиоактивное мсчснис мРНК, трансляция
9. УФперешивка и иммуногтрецнлигацня.
. Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидном геле
. Анализ изменения подвижности комплексов белокРНК в геле
. Связывание белков с полмЛ на нитроцедлюлозных фильтрах
. Анализ стабильноеги мРНК viv и i vi
блог анализ.
. Анализ зашиты мРНК от эндокуклеазной деградации.
Дрожжевая двухгмбрндкзя система
. Комммунопрецнпигация р и актина .
. Связывание и соосаждеиие р с актином.
. v анализ
Анализ структурных пересфоек актина
. Иммунофлуореснентная микроскопия
Результаты
I СООТНОШЕНИЕ ДВУХ МАЖОРНЫХ БЕЛКОВ, р и РАВР, В СОСТ АВЕ мРНП ОПРЕДЕЛЯЕТ ТРАНСЛЯЦИОННУЮ АКТИВНОСТЪ мРНК.
1.1. р и РАВР связывают полиА с одинаковой аффинностью
1.2. р и РАВР конкурируют за связывание с полнАхвоетом мРНК
1.3. р и РАВР оказывают противоположный эффект на трансляционную активность vi
1.4 Содержание р и РАВР в составе мРНП варьирует в зависимости от функционального
состояния клетки
I 5 Фосфор ил ировонис р является потенциальным механизмом регуляции его функциональной
активности
2. р ОБЕСПЕЧИВАЕТ СТАБИЛИЗАЦИЮ мРНК КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ
2.1 робеспечивает полную стабилизацию мРНК в различных клеточных экстрактах
2.2 Увеличение количества р н клетках НсЬа приводит к полной стабилизации мРНК .
2.3 Домен чолодового шока р обеспечивает стабильность мРНК, но не влияет на е трансляционную активность.
2.4. Удаление р из клеточного экстракта приводит к дестабилизации мРНК
2.5. р обеспечивает полную стабилизацию кэпированной и полиадемилировамной мРНК,. 2.6 р полностью защищает полиАхвост от действия эндонуклеаз, но не препятствует
эмдокуклеазной деградации тела мРНК
3 р ЯВЛЯЕТСЯ АКТИНСВЯЗЫВАЮЩИМ БЕЛКОМ.
3.1 Идентификация актина как белка, аэаимодейтвующего с р, с помощью двухгнбркдной дрожжевой системы.
3.2 р взаимодействует с актином в клетках эукариот
3.3. р коседнментируст с акгииокыми ммкрофиламсктами.
3.5 Сравнение эффективности связывания р с полимерной и мономерной формами актина
3.6 р организует нити Кактина в более крупные фибриллы
3.7 р локализуете на актнновом цитоскелетс в мышиных фибробластах
Обсуисденме.
1. Соотношение дву мажорных белков. р и РАВР. в составе мРНП определяет трансляционный статус мРНК
2. р обсспечкваег стабильность мРНК в клетках эукариот .
3. р является актнсвязывающим белком.
Выводы.
Благодарности
Список Литерату


Оказалось, что за эту специфическую полиАорганичукицую активность отвечает РАВР, причм 1 молекула РАВР связывает аденнновых остатков. Анализ последовательности кДНК Р. АРВ показал, что он i из четырех высококонсервативных РНКсвязываюших доменов ii i, и мснсс консервативного пролннглугамин богатого Сконцсвот домена см. Известно более 0 белков, содержащих и найденных в бактериях, грибах, растениях и у животных см. Высокая консервативность в эволюции и широкая распространенность этого структурною мотива, вероятно, свидетельствует о ею функциональной важности. Типичный i из 0 аминокислотных остатков и содержит две консервативные последовательности 1 iVX, где X любой аминокислотный остаток, и 2 V. Анализ РНКсвязывающей акгивности показал, что ни один из отдельных РАВР не способен взаимодействовать с полиЛ специфично и эффективно. РНК, причм каждая комбинация III, IIIII, IIIIV обладает различными РНКсвязывающимн свойствами в. Только тандем из двух концсвых доменов способен обеспечивать специфическое узнавание полкАпоследователыюсти, причем аффинность к полиА каждого из доменов в отдельности относительно невелика Недавно были получены данные рснгснострухтурного анализа I III в комплексе с полиАполинуклеотидом с разрешением 2,6 . Оказалось, что основу центра связывания составляют антипараллельные листы, формирующие длинный узкий туннель, в то время как межцепочечные петли и междоменные линкеры формируют его боковые части. ПолнА принимает форму активного центра доменного тандема путем форхшрования ван дер Ваальсовых контактов, водородных связей и стэкинговых взаимодействий с консервативными ароматическими аминокислотными остатками в составе мотивов этих . Несмотря на высокую гомологию между отдельными доменами, аффинность IIV к полиАгомополимсру в раз ниже, чем у 1. Было показано, что I III1V имеют преимущественное сродство к гетсрологичным олигорпбонуклсотпдам, точечные мутации в этих доменах нарушали связывание с различными РНК i, , , . Более того, метолом ультрафиолетовой перешивки было показано, что полноразмерный РАВР формирует независимые контакты с мРНК посредством 1Л1 и IIIIV. Интересно, что отдельные РАВР имеют большую гомологию с другими содержащимн белками, чем между собой. Вероятно, это указывает на функциональную неэквивалентность каждого оделъного РАВР. Эксперименты с делецнопиыми мутантами РАВР продемонстрировали, что каждый отдельный домен РАВР может быть удален и такой мутантный белок будет способен обеспечивать выживаемость дрожжевых клеток с делецией гаер гена о. Однако, одновременные мутации в II и IV легальны для клетки . Таким образом, РАВР обладает несколькими различными и разделенными активностями I1I, вероятно, обеспечивает функционирование РАВР в полнАзависимой трансляции, в то время как IIIIV i обеспечивать связывание РАВР с другими участками той же самой мРНК или с другими молекулами II см. Таким образом. РАВР является мультифункционапьным белком, имеющим множество активностей полиАспецнфичсскую, за счет III, неспецнфическую. I1I1V, а также структурообразующую, обусловленную IIV н Сконцсвым доменом Не исключено также, что Сконец может взаимодействовать с другими резуляюрными белками и изменять структуру полиАхвоста мРНК, тем самым, оказывая влияние на се трансляционную активность. Структурные и функциональные свойства р и родственных УН белков Определение первичной структуры кДНК р, полученной из библиотеки ретикулоцитов кролика, показало высокую степень гомологии идентичности с семейством белков, известных как xсвязывающие x, . Члены этого семейства белков были впервые обнаружены более лет назад благодаря их специфическому связыванию с последовательностью , найденной в промоторах и энхансерах многих генов ii . Все эти белки содержат концсвую аминокнслотную последовательность, так называемый домен холодового шока i, , последовательность которого почти полностью идентична у всех позвоночных более идентичности. Этот домен имеет около идентичности и более гомологии с мажорным белком холодового шока . I, , , , i, .