Структура и динамика вольт-сенсорного домена K+ канала KvAP по данным гетероядерной ЯМР-спектроскопии

• Автор: Парамонов, Александр Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

Оглавление

Список иллюстраций

Список таблиц

Введение б

Глава 1. Обзор литературы

1. Исследование структуры мембранных белков. Мембраномоделирующие среды

1.1. Общие сведения о мембранных белках

1.2. Метод ЯМР и его применение к мембранным белкам

1.3. Свойства различных типов мембранных миметиков .

2. Липидбелковые ианодиски.

2.1. Липопротеины плазмы крови млекопитающих

2.2. Структура и свойства ЛБН
2.3. Использование ЛБЫ для солюбилизации мембранных
белков и пептидов
2.4. ЛБЫ в ЯМРспектроскопии высокого разрешения . .
3. Потенциалзависимые ионные каналы
3.1. Общая схема строения катионных каналов
3.2. Классификация каналов.
3.3. Принципы потенциалзависимой активации
Глава 2. Материалы и методы
1. Получение объектов исследования и реактивы.
1.1. Получение Антиамебина I.
1.2. Наработка и выделение ВСДКуАР
1.3. Реактивы
1.4. Получение ЛБЫ в комплексе с ВСДКуАР и ААМ I .
2. Экспериментальные методики.
2.1. Подбор условий для структурных ЯМРисследований
ВСДКуАР.
2.2. Исследование ААМ 1 и ВСДКуАР в комплексе с ЛБЫ
2.3. Анализ размера частиц.
2.4. Структурные исследования ВСДКуАР.
2.5. Определение динамических характеристик ВСДКуАР
2.6. Расчет химических сдвигов.
Глава 3. Результаты и обсуждение
1. Подбор мембраномоделирующей среды
2. ЛБН в качестве мембраномоделирующей среды
2.1. Исследование ААМ1 в комплексе с ЛБН методом ЯМР
2.2. ЯМ Рисследование ВСДКуАР в комплексе с ЛБН . .
3. Структура ВСДКуАРв мицеллах.
3.1. Отнесение сигналов .
3.2. Вторичная структура ВСДКуАР в мицеллах.
3.3. Данные о пространственной структуре ВСДКуАР . .
3.4. Расчет химических сдвигов.
3.5. Выводы о структуре ВСДКуАР в мицеллах
ДФХЛДАО .
4. Внутримолекулярная динамика ВСДКуАР в мицеллах
ДФХЛДАО .
Заключение
Выводы
Благодарности
Список сокращений
Литература


Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ЯМР один из наиболее мощных методов структурного анализа. Он позволяет определять не только пространственную структуру изучаемых белков, но и их внутримолекулярную динамику . Для изучения мембранных белков этим методом требуется применение сред, моделирующих биологическую мембрану . Используемые в настоящее время мембраномоделирующие среды в основном, мицеллы детергентов не во всех случаях обеспечивают сохранение нативной структуры исследуемого белка. Таким образом, выбор мембраномоделирующей среды является актуальной проблемой для современных ЯМРисследований . В литературе имеются данные о свойствах принципиально новой среды для солюбилизации мембранных белков так называемых лпппдбелковых нанодисков ЛБН . Нанодиски представляют собой фрагмент плоского липидного бислоя 0 фосфолипидов, гидрофобные края которого экранированы от растворителя двумя молекулами амфифильного белка МБР фрагмента аполипопротеина А1 из липопротетшов высокой плотности плазмы крови человека. Ранее ЛБН успешно применялись в исследованиях мембранных белков различными методами. Выло показано. ЛБН по своим свойствам наилучшим образом соответствуют биологической мембране и способны сохранять многие мембранные белки в нативном функциональном состоянии . Однако, примеров использования ЛБН для структурных ЯМРисследований мембранных белков на сегодняшний день нет. Цели и задачи исследования. Цслыо работы являлось определение структурных и динамических характеристик изолированного ВСДКуАР методами ЯМР высокого разрешения. Подбор мембраномоделирующей среды для ЯМРисследований ВСДКуАР, обеспечивающей наилучшее качество ЯМРспектров и сохраняющей структуру белка, наиболее близкую к нативной. Получение отнесения сигналов ВСДКуАР в гетсроядерных ЯМРспектрах. Идентификация элементов вторичной структуры ВСДКуАР по данным ЯМР. Получение данных о пространственной структуре белка. Определение характеристик внутримолекулярной динамики ВСДКуАР. Научная новизна и практическая значимость работы. Показана применимость ЛБН, созданных на основе липопротеинов высокой плотности человека, в качестве мембраномоделирующей среды для ЯМРисследований мембранных белков и пептидов. Предложен новый метод подбора мембраномоделирующей среды на основании сравнения спектров ЯМР изучаемого белка в различных средах со спектрами в ЛВН. Показана и исследована зависимость структуры ВСДКуАР от состава мембраномоделнрующей среды. Получено практически полное отнесение сигналов ЯМР атомов основной цепи и большей части Сатомов ВСДКуАР в комплексе с мицеллами ДФХЛДАО 21. Определена вторичная структура ВСДКуАР в комплексе с мицеллами ДФХЛДАО 21. Получены данные о его пространственной структуре. Определены характеристики внутримолекулярной подвижности ВСДКуАР в комплексе с мицеллами ДФХЛДАО 21. Проведено сравнение существующих моделей потенциалзависимой активации канала с полученными данными. В данной работе разработай и успешно применен новый подход к определению пригодности мембраномоделирующих сред для ЯМРспектроскопии мембранных белков, который предполагает сопоставление спектров белка в тестируемых детергентах и в ЛБН. Доказательство сохранения солюбилизированным белком нативной структуры является одной из основных проблем в современных исследованиях. Таким образом, данный подход может найти широкое применение в ЯМРиееледованиях мембранных белков. Полученные в работе значения химических сдвигов сигналов ядер АН, С, И в спектрах ЯМР ВСДКуАР могут служить отправной точкой при его дальнейших структурнодинамических исследованиях, например, для получения структуры с высоким разрешением. Кроме того, отнесение сигналов основной цепи необходимо для исследования механизмов взаимодействия КуАР с токсинами или для скрининга прототипов лекарственных средств, модулирующих потенциалзависимую активацию. Полученные данные о внутримолекулярной динамике ВСДКуАР позволяют снять некоторые противоречия между разными моделями потенциалзависимой активации каича КуАР.