Структурно-функциональные исследования молекулярных механизмов взаимодействия Rab-ГТФаз с их молекулярным партнером, белком GDI

• Автор: Игнатьев, Александр Валентинович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 93 с. : ил.

Содержание
СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Общая характеристика белков.

Структурная характеристика белков

Пренилирование белков

Транспорт белков.

Взаимодействия I с гипервариабельным доменом .

Интеграция белка в мембрану

Экстракция белка из мембраны.
Регуляторы обмена нуклеотидов в
Участие белков в регуляции транспорта везикул
Медицинские аспекты нарушения функций белков и их
молекулярных партнеров.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы и оборудование
Методы.
Выделение плазмидной ДНК
Электрофорез в агарозном геле.
Получение компетентных клеток . i и их трансформация
Полимеразная цепная реакция.
Обработка ДНК сайтспецифическими эндонуклеазами
Очистка фрагментов ДНК
Лигирование ДНК.
Выделение дрожжевого I
Выделение белков
Формирование комплекса I
Формирование комплекса I и
Получение фарнезилированных производных.
Гельэлектрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии
Гельфильтрация в системе
Определение молекулярных масс белков
Калориметрическое титрование
Кристаллизация белков.
Тестирование кристаллов и рентгеноструктурный анализ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение комплексов и определение их пространственных
структур
Определение аффинности связывания вО с непренилированными
ЯаЬ белками.
Взаимодействие вО с пренилированными производнымиУрП
Модель, описывающая формирование комплекса и ОО
индуцируемой экстракции КаЬ белков из мембраны
Заключение
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Транспорт белков. Взаимодействия I с гипервариабельным доменом . Экстракция белка из мембраны. Методы. Электрофорез в агарозном геле. Получение компетентных клеток . Полимеразная цепная реакция. Лигирование ДНК. Получение фарнезилированных производных. . Кристаллизация белков. Определение аффинности связывания вО ЯаЬ белками. ВЫВОДЫ. В процессе эволюции в эукариотических клетках сформировались механизмы транспорта молекул и частиц, обеспечивающих жизнедеятельность клеток. Выделяют два направления транспорта в клетках. Эндоцитоз включает поглощение макромолекул и частиц с клеточной поверхности, транспорт этих макромолекул и частиц в ранние эндосомы, где они подвергаются сортировке, а затем деградации в лизосомах. Экзоцитоз обеспечивает доставку новосинтезированных трансмембранных и внеклеточных белков к плазматической мембране клетки через эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольджи, а также транспорт внутриклеточных белков в лизосомьт и эндоплазматический ретикулум, либо в цистерны комплекса Гольджи. Транспорт содержимого от одного компартмента клетки к другому сопровождается образованием мембранных структур, везикул, выполняющих функцию переносчиков. Таким образом, экзоцитоз и эндоцитоз, а также рециклизация рецепторных молекул, тесно связаны с процессом везикулярного транспорта. Везикулы также вовлечены в передачу внутриклеточных сигналов, которые могут быть инициированы на поверхности клетки в результате активации различных рецепторов и приводящих к запуску внутриклеточных процессов. Кроме того, везикулярный транспорт необходим для обеспечения клеточной полярности и движения клеток. Для регуляции каждого этапа везикулярного транспорта в клетках существуют специфические факторы. Экспериментально было показано, что белки и их эффекторы участвуют в координации и регуляции почти всех этапов транспорта везикул vi Р. Регулирующая функция основана на их способности функционировать в качестве молекулярных переключателей, которые могут существовать в активном ГТФсвязанном и неактивном ГДФсвязанном состояниях. Активное состояние характеризуется способностью взаимодействовать с эффекторными молекулами, тогда как в неактивном состоянии белки взаимодействуют в основном с регуляторными молекулами. В свою очередь цикл замены нуклеотида регулируется активирующими факторами x и ivi i и сопряжен с циклом обратимого перемещения между мембранами донорных и акцепторных внутриклеточных компартментов. Данный транспорт белков осуществляется посредством белковых факторов семейства Локализация на мембранах обеспечивается наличием в их составе геранилгеранильных групп, присоединение которых к Сконцевым цистеинам белков происходит в процессе посттрансляционной модификации. Результаты предыдущих работ, в которых были определены структуры некоторых белков и их молекулярных партнеров, а также биохимические и. ГТФаз и механизм гидролиза ГТФ, включающий вовлечение активирующих белков. Предложены модели взаимодействия белков с другими эффекторами. Идентифицированы потенциальные партнеры, участвующие в интеграции белков в мембраны и экстракции из них, хотя механизмы этих процессов требуют дальнейшего изучения. Экспериментально также показано, что нарушение функций или изменение уровней экспрессии некоторых белков и их молекулярных партнеров являются причинами большого числа заболеваний и вызванымутациями генов, кодирующих белки иили ассоциированных с ними молекулярных партнеров. Как упоминалось ранее, за транспорт в цитозоле. I. В работах . ,, , ,9 обсуждались структуры белковых комплексов дрожжевого белка и 7 с I iii Iii и 1 i, соответственно. Трехмерные структуры этих комплексов, а также структуры I и , позволили определить элементы, участвующие в формировании белковых комплексов.