Сопряжение между фотосистемой 1 и цитохромным b6f комплексом в модельных системах

• Автор: Витухновская, Лия Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Место защиты: Б.м.
• Количество страниц: 126 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурные особенности ЦИТОХрОМНОГО Ькомплекса

1.1.1. Дополнительный гем на стромальной поверхности

сайта гем х и его функции

1.1.2. Хлорофилл а у каротинойд и эндогенные липиды

1.1.3. Сходство и различие цитохромного Ъкомплекса

с цитохромным Ьс комплексом

1.2. Перенос электронов В цитохромном Ькомплексе

1.2.1. Перенос электронов от хииола к высоко
и низкопотенциальным цепям
1.2.2. Перенос электронов к цитохрому через протеид Риске
1.2.3. Электрогснные реакции в Ьс и в комплексе
1.2.4. Циклический транспорт электронов
1.2.5. Ингибиторы Ькомплекса
1.3. Перенос электронов от цитохрома к фотосистеме
1.4. Структурные аспекты ФС 1
1.4.1. Строение цианобактериальной ФС 1
1.4.2. Строение эукариотической ФС 1
1.5. Электрон транспортная цепь
1.5.1. Современные данные по переносу электронов в ФС
1.5.1.1. Первичный перенос электронов от возбужденного Р
через А0 к А
1.5.1.2. Вторичный перенос электронов от А к железо серным кластерам Бх Бд Рв
1.5.1.3. Перенос электронов от Рв на ферредоксин флаводоксин
1.6. Фотосинтстическис гибридные системы в растворе
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ
2.1.1. Используемые реактивы
2.1.2. Выращивание клеток ЗупесНосувМь . РСС
2.1.3. Выделение фотосистемы 1
2.1.4. Выделение цитохромного Ькомплекса
2.1.5. Измерение активности цитохромного комплекса
2.1.6. Выделение пластоцианина
2.1.7. Выделение цитохрома са
2.1.8. Химическое восстановление децилпластохинола
2.1.9. Получение протеолипосом
2.2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
2.2.1. Измерение спектров оптического поглощения
2.2.2. Светоиндуцированные изменения оптического поглощения
2.2.3. Регистрация светоиндуцированной кинетики
генерации трансмембранного потенциала в гибридных системах
2.2.4. Кинетический анализ сигналов
2.2.5. Измерения спектров ЭПР ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Кинетические исследования переноса электрона в гибридной системе, состоящей из цитохромного Ькомплекса и ФС 1 в растворе.
3.1.1. Взаимодействие ФС 1 в гибридной системе с донором электронов
цит с6 в растворе
3.1.2. Исследование гибридной системы в растворе с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии
3.2. Кинетические исследования переноса электрона в гибридной системе, состоящей из цит комплекса и ФС 1 в протеолипосомах.
3.2.1 Ориентация цитохромного Ькомплекса
и ФС 1 в протеолипосомах
3.2.2. Исследование сопряжения белков в протеолипосомах
методом импульсной абсорбционной спектрометрии
3.2.3. Изучение гибридной системы методом
электронного парамагнитного резонанса
3.2.4. Исследование гибридных протеолипосом,
содержащих ФС 1 и цит Ькомплекс методом ЭПР
3.2.4.1. Регистрация Д в протеолипосомах
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Были оценены расстояния между кофакторами ферментов, а также выявлены основные структурные особенности комплекса, в частности, был найден новый, ковалентносвязанный гем , повидимому, относящийся к гемам типа с Предполагается, что гем х может участвовать в циклическом перенос электронов. Транспорт электронов между комплексом и ФС 1 ранее изучали, главным образом, на нативных объектах листьях высших растений, хлоропластах, субхлоропластных частицах и клетках цианобактерий. Перенос электронов между выделенными из высших растений белками ФС 1 и исследовали только в растворе i , . В нашей работе впервые была предпринята попытка изучить взаимодействие между этими двумя пигментбелковыми комплексами в мембранах протеолипосом с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии, ЭПР спектроскопии и прямого электрометрического метода. i, и целых клетках i i, , . Этот метод, несмотря на широкое применение, является косвенным, и при интерпретации данных не вполне однозначным. Было предположено, что основная электрогениая стадия обусловлена переносом электрона между двумя темами 6, в то время как оставшиеся электрогенеза, вероятно, связаны с окислением цитохрома Ъ иили с поглощением протонов из стромы при восстановлении в сайте . Тем не менее, анализ литературных данных показывает, что как механизмы сопряжения электронного транспорта с образованием А у в цит Ь комплексе, так и природа наблюдаемых электрогенных стадий остаются невыясненными. Более прямым способом регистрации образования мембранного потенциала является электрометрический метод, разработанный в ПИИ ФХБ им. АЛI. Белозерского МГУ. Раисе этот метод был успешно применен для изучения природы и механизмов электрогенных реакций в функциональном аналоге комплекса цитохромном Ьс комплексе пурпурных фотосинтезирующих бактерий. Однако электрометрический метод не применим к целым клеткам и хлоропластам. Для регистрации мембранного потенциала этим методом необходимо было выделить комплексы и ФС 1, встроить их в мембраны протеолипосом и подобрать условия эффективного взаимодействия. В настоящей работе электрогенные реакции, сопровождающие перенос зарядов в цит комплексе были впервые исследованы в модельной системе. Применение прямого электрометрического метода позволяет с большей достоверностью определить природу электрогенных реакций в комплексе и относительный вклад отдельных реакций переноса зарядов в суммарный электрогенез. Целью настоящей работы явилось изучение генерации трансмембранной разности электрических потенциалов в цит комплексе с промощью прямого электрометрического метода, разработанного в НИИ ФХБ им А. МГУ, в модельной системе, состоящей из выделенных белков ФС 1 И комплекса. Для этого были проведены предварительные эксперименты с использованием методов импульсной абсорбционной спектрометрии и ЭПР спектроскопии. Сконструировать функциональноактивную гибридную систему, состоящую из ФС 1 и цитохромного комплекса, а также продемонстрировать ее функционирование с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии. Подобрать условия встраивания ФС 1 и цитохромного комплекса в мембраны протеолипосом и определить их ориентацию в мембранах. Исследовать индуцированные светозависимым окислением Р0 в ФС 1 редокс реакции цитохромов к растворе и в гибридных нротеолипомах. Продемонстрировать взаимодействие между ФС 1 и цигохромным комплексом в протеолипосомах путем регистрации свстозависимых сигналов ЭПР от катионрадикала Р0. С помощью прямого электрометрического метода изучить индуцированное лазерными вспышками образование трансмембранной разности электрических потенциалов, генерируемое цит комплексом в гибридных протеолипосомах. Научная новизна работы. Впервые была сконструирована функциональноактивная модельная система, включающая выделенные пигментбелковые комплексы цит и ФС 1 в мембранах протеолипосом. На основании результатов, полученных с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии, продемонстрировано эффективное взаимодействие двух белков в этой системе. Окислительновосстановительные реакции цит инициировались светоиндуцированным окислением Р0.