Исследование структуры и свойств мембранных рецепторов : рецептора фактора роста эпидермиса человека и галобактериального трансдьюсера

• Автор: Будяк, Иван Леонидович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

Актуальность проблемы

Цели и задачи работы

Научная новизна

Обзор литературы

1.1 Введение классификация клеточных рецепторов, про и

эукариотические рецепторы класса I

1.2 Галобактериальный трансдьюсер 2 из i i

1.2.1 Фототаксис в i i сенсорный родопсин 2 и трансдьюсер 2

1.2.2 Хемотаксис в ii i и i аспартатный и сериновый рецепторы
1.2.3 Современные представления о механизмах передачи сигнала в системах фото и хемотаксиса
1.3 Рецептор фактора роста эпидермиса человека
1.3.1 Физиология и структура рецептора фактора роста эпидермиса человека
1.3.2 Современные представления о механизмах передачи сигнала рецептором фактора роста эпидермиса человека
1.4 Формулировка целей диссертационной работы Материалы и методы
2.1 Оборудование и материалы
2.1.1 Оборудование
2.1.2 Материалы и химические реагенты
2.1.2.1 Ферменты для генной инженерии
2.1.2.2 Праймеры
2.1.2.3 Маркеры для гельэлектрофореза
2.1.2.4 Носители для хроматографических колонок
2.1.2.5 Детергенты и липиды
2.1.3 Растворы
2.1.3.1 Буферные растворы для работы с ДНК
2.1.3.2 Буферные растворы для секвенирования
2.1.3.3 Буферные растворы для агарозного гельэлектрофореза
2.1.3.4 Буферные растворы для гельэлектрофореза в ДСН
2.1.3.5 Буферные растворы для иммунноблоттинга
2.2 Клонирование, работа с .i и клетками млекопитающих
2.2.1 Бактериальные штаммы, клеточные линии и плазмидные векторы
2.2.1.1 Бактериальные штаммы и клеточные линии
2.2.1.2 Плазмидные векторы 3
2.2.1.3 Питательные среды и пищевые добавки
2.2.2 Методы клонирования
2.2.2.1 Агарозный гельэлектрофорез
2.2.2.2 Определение первичной последовательности ДНК
2.2.2.3 Полимеразная цепная реакция
2.2.2.4 Очистка продуктов полимеразной цепной реакции
2.2.2.5 Лигирование вставки в плазмидный вектор
2.2.3 Работа с клетками .i
2.2.4 Работа с клетками линии 1
2.2.5 Работа с клетками линии НЕК 3
2.3 Очистка и приготовление образцов белков
2.3.1 Выделение и очистка цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2
2.3.2 Выделение и очистка цитоплазматического домена рецептора фактора роста эпидермиса человека
2.3.3 Выделение и очистка трансмембранного примембранного
доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека
2.3.4 Анализ качества рекомбинантных белков
2.3.4.1 Полиакриламидный гельэлектрофорез в ДСН
2.3.4.2 Иммунологический анализ
2.3.4.3 Измерение концентрации белков
2.4 Биофизические и биохимические методы исследования белков
2.4.1 Массспектрометрия
2.4.2 Круговой дихроизм
2.4.3 Ядерный магнитный резонанс
2.4.4 Инфракрасная Фурьеспсктроскопия
2.4.5 Аналитическая гельфильтрационная хроматография
2.4.6 Кросслинкинг
2.4.7 Малоугловое рассеяние нейтронов
2.4.8 Атомная силовая микроскопия
Результаты и их обсуждение галобактериальный трансдьюсер 2 из i i
3.1. Клонирование, экспрессия и очистка цитоплазматического
домена галобактериального трансдьюсера 2
3.2 Молекулярная масса и предполагаемые сайты метилирования цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера
3.3 Вторичная структура и конформационные изменения цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера
3.3.1 Исследование вторичной структуры и конформационных изменений цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью кругового дихроизма
3.3.2 Исследование вторичной структуры и конформационных изменений цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью ядерного магнитного резонанса
3.3.3 Исследование вторичной структуры и конформационных изменений цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью инфракрасной Фурьеспектроскопии
3.4 Олигомеризация и агрегация цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2
3.4.1 Исследование олигомеризации и агрегации цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью аналитической гельфильтрационной хроматографии
3.4.2 Исследование олигомеризации и агрегации цитоплазматического домена галобактериального трансдьюсера 2 с помощью кросслинкинга
3.5 Структурный анализ цитоплазматического домена
галобактериального трансдьюсера 2
3.5.1 Структурный анализ цитоплазматического домена
галобактериального трансдьюсера 2 с помощью малоуглового рассеяния нейтронов
3.5.2 Структурный анализ цитоплазматического домена
галобактериального трансдьюсера 2 с помощью атомной силовой микроскопии
3.6 Предсказания конформационной подвижности и вторичной структуры сравнительный анализ
3.7 Модель передачи сигнала в системе сенсорный родопсин 2галобактериальный трансдьюсер 2 в 1Ча1гопоЬасепит ркагаош
Результаты и их обсуждение фактор роста эпидермиса человека
4.1 Клонирование и экспрессия внеклеточного трансмембранного
доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека
4.2 Клонирование, экспрессия, очистка и характеризация
цитоплазматического домена рецептора фактора роста эпидермиса человека
4.3 Клонирование, экспрессия и очистка трансмембранного
примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека
4.4 Олигомеризация и агрегация трансмембранного
примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека
4.4.1 Исследование олигомеризации и агрегации трансмембранного
примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека с помощью кросслинкинга
4.5 Структура и конформационные изменения трансмембранного
примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека
4.5.1 Исследование вторичной структуры и конформационных
изменений трансмембранного примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека с помощью кругового дихроизма
4.5.2 Исследование структуры и конформационных изменений
трансмембранного примембранного доменов рецептора фактора роста эпидермиса человека с помощью ядерного магнитного резонанса
Выводы
Список использованной литературы


Клонирование, работа с . Работа с клетками . Все живые организмы состоят из клеток. Жизнь каждой клетки происходит в тесном взаимодействии с другими клетками и окружающей средой. Это взаимодействие немыслимо без поступления сигналов извне, их передачи, обработки и соответствующей реакции. Таким образом, системы передачи и обработки сигналов в клетке являются одной из важнейших областей исследований современной биологии. В данной работе были изучены два белка галобактериальный трансдьюсер 2 Гтр2 из i i и рецептор фактора роста эпидермиса РФРЭ из i. Оба эти белка отвечают за трансмембранную передачу сигнала и выполняют важные функции в клетке. Нас интересовали характерные особенности устройства этих систем, возможность выделить некоторые черты и закономерности, присущие им обоим. Архебактерий и является типичным экстремальным галофилом, предпочитая для обитания водоемы с высоким содержанием неорганических солей. При недостатке питательных веществ и кислорода . АТФ, при избытке старается избегать освещнных участков изза риска фотоокисления ДНК ультрафиолетом. Для этого клеткой синтезируются сенсорный родопсин 2 СР2 и Гтр2, образующие в мембране комплекс со стехиометрией 1. После возбуждения СР2 квантом света рецептор претерпевает конформационные изменения, которые затем передаются на Гтр2 2. Трансдьюсер модулирует активность цепи киназ, в конечном счте определяющих частоту переключений флагеллярного мотора, что, в свою очередь, влияет на направление движения клетки таким образом, чтобы она оставалась преимущественно в затеннных областях. Гтр2 представляет собой 2 трансмембранные спирали и относительно большой цитоплазматический домен Гтр2цит. Белок имеет высокую степень гомологии с эубактериальными хеморсцепторами, что говорит об их функциональном и эволюционном родстве 3. Структуры и механизм взаимодействия СР2 и Гтр2 в мембранной области уже известны, однако детали передачи сигнала цитоплазматическим доменом до конца не ясны. Таким образом, цитоплазматический домен Гтр2 является недостающим звеном в понимании работы системы отрицательного фототаксиса в АКрЬагаотБ. Поэтому первая часть работы была посвящена структурной характеризации Гтр2цит и исследованию фолдинга этой части Гтр2. РФРЭ человека играет важнейшую роль в жизни клетки и организма. Белок состоит из трех основных доменов внеклеточного, ответственного за связывание с лигандом, трансмембранного и внутриклеточного, имеющего в своем составе тирозинкиназу. Связывание лиганда с внеклеточным доменом РФРЭ активирует киназу, запускающую многочисленные сигнальные пути. Отклонения от нормального функционирования грозят глубокими нарушениями в работе клетки вплоть до е злокачественного перерождения
Структуры внеклеточного домена РФРЭ и тирозинкиназы известны . Тем не менее, роль трансмембранного домена остается непонятной он может быть как пассивным мембранным якорем, так и активно участвовать в передаче сигнала. Прилегающая к мембране примембранная и богатая основными аминокислотными остатками область, следующая непосредственно за трансмембранным доменом РФРЭ, как было недавно показано, тоже имеет важное функциональное значение. Не ясно, однако, какую роль эта область играет в передаче сигнала. Вторая часть данной работы была посвящена исследованию трансмембранной и прилегающей к мембране областям РФРЭ тмпРФРЭ. Также были частично изучены внеклеточный и внутриклеточный домены РФРЭ.