Исследование физико-химических свойств кальцийсвязывающих белков с помощью комбинированного применения генноинженерных, спектральных и калориметрического методов

• Автор: Пермяков, Сергей Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 117 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Исследование кальцийсвязыбающих белков методами белковой инженерии.

Предмет рассмотрения.

Классификация работ по исследованию калъцийсвязывающих белков методами белковой

инженерии

Мутации с целью введения репортрных групп

Мутации в кальцийсвязывающих центрах

Создание искусственных кальцийсвязывающих центров в белках..

Мутации вне кальциевых центров белков, химерные белки.

Структурные и функциональные свойства схлактальбумима
Структурные и функциональные свойства рековерина
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Использованные реактивы.
Общие процедуры.
Генноинженерные и биохимические методы
Приготовление апоформы рековерина
Сайтнаправленный мутагенез алактальбумина.
Проверка фолдинга рекомбинатного алактальбумина
Удаление концевого метионина у мутантов алактапъбумина.
Физические методы исследования
Измерение спектров кругового дихроизма
Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия
Измерение и анализ спектров стационарной флуоресценции
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование факторов, обуславливающих отличие свойств рекомбинантного аЛА
от нативного
Исследование структурнофункциональной роли Са2связывающего остатка
Изучение механизма связывания ионов Са2 рековерином
Локализация сильного 2м2связывающего центра аЛАКТлльБУминл.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


На сегодня известно несколько сотен белков, входящих в этот класс. Подробное исследование их структуры и свойств началось примерно лет назад, и в настоящее время о некоторых из этих белков мы имеем очень детальную структурную и физикохимическую информацию см. Пермяков, Пермяков, . Достаточно сказать, что для нескольких десятков кальцийсвязывающих белков известна трхмерная структура, причм в некоторых случаях она определена методом рентгеноструктурного анализа для кристаллов белка, а в некоторых также и методом ЯМР для белка в растворе. В последнее десятилетие для исследования структуры и свойств кальцийсвязывающих белков были довольно широко привлечены методы белковой инженерии. Появление этих методов предоставило исследователям уникальную возможность осуществления экспериментов, недоступных ранее, причм возможности их применения ограничены лишь фантазией экспериментатора. Это привело к появлению целого ряда важных и интересных работ, опирающихся на такой инструментарий. Настоящая работа посвящена дальнейшему развитию способов комбинированного применения методов генетической инженерии и спектральных и калориметрических методов для исследования кальцийсвязывающих белков. В качестве примера были взяты два резко различающихся по структуре и свойствам кальцийсвязывающих белка алактальбумин а1 из коровьего молока и рековерин из сетчатки глаза крупного рогатого скота. Их свойства изучали путм комбинированного применения сайтнаправленного мутагенеза, флуоресцентной спектроскопии, спектроскопии кругового дихроизма, а также дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. ЛА модификатор галактозилтрансферазы в комплексе лактозасинтетазы глобулярный белок с массой кДа, обладающий единственньш сильным Са2связывающим центром v . i i v . . Кальцийсвязывающий домен аЛА отличается от канонической руки, хотя он также состоит из двух спиралей и петли между ними, образуя структуру типа локоть . Рековерин фоторецепторный белок из палочек сетчатки также глобулярный белок с массой кДа, содержащий четыре потенциальных кальцийсвязывающих домена типа рука, из которых только домены II и III спообны связывать кальций . i . . Для обоих белков хорошо известны как аминокислотная последовательность, так и трхмерная структура, что делает их подходящими кандидатами для использования для их исследования метода белковой инженерии. Исследование кальцийсвязывающих белков методами белковой инженерии. Рассмотрим результаты применения методов белковой инженерии для исследования наиболее известных кальцийсвязывающих белков, обладающих наивысшим сродством к ионам кальция, с хорошо известной трхмерной структурой. Необходимо отметить, что последний фактор является одним из основных условий возможности эффективного использования методов генной инженерии для исследования структуры и свойств белка. Только в этом случае можно осознанно планировать соответствующие поставленной задаче замены аминокислотных остатков. Поскольку кристаллизация апоформ, как правило, сильно затруднена, подавляющее большинство имеющихся рентеноструктурных данных относится к кальцийсвязанным формам белков. Кауазак е а. На Рис. Рис. ЕРцснтр парвальбумина карпа р1 4, по данным рентгеноструктурного анализа 4СРУ структура РИВбанка. Рис. Са2тсвязывающей петли между ними . Спирали можно представить себе вытянутыми большим и указательным пальцами, а кальцийсвязывающую петлю согнутым средним пальцем правой руки. Рис. Рис. Комплекс кальмодулина i i с ионами кальция по данным ренгеноструктурного анализа I структура банка. Кальмодулин универсальный Са2зависимый активатор активности большого числа ферментов фосфодиэстераза циклических нуклеотидов, аденилатциклаза, киназа легких цепей миозина, и др. Молекула кальмодулина напоминает гантель ВаЬи е а1. Кгегэег е а. ЕРрука, соединнные восьмивитковой спиралью Рис. Са2 так и ионы М.