Иммобилизованные биокатализаторы на основе полигистидинсодержащих производных органофосфатгидролазы: получение и свойства

• Автор: Лягин, Илья Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.02, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 152 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Каталитические характеристики и субстратная специфичность ОРИ

1.2. Пол и гистидинсодержащие белки и носители для их иммобилизации

1.2.1. Полигистидинсодержащие белки.

1.2.2. Полигнстидинсодержащие производные ортнофосфатгидролазы

1.2.1. Носители для иммобилизации рЫуШзеодержащих белков.

1.3. Биокатализаторы на основе иммобилизованной ОРН и с производных.

1.4. Фосфонаты и методы их деструкции

1.4.1. Химическая детоксификация ФОВ проблема и методы се решения

1.4.2. Деструкция СР связи в фосфоновых кислотах и их производных

1.4.2.1. Щелочной и кислотный гидролиз
1.4.2.2. Деструкция СР связи в фосфонатах с использованием металл оком плсксов
1.4.2.3. Окислительное разрушение СР связи в фосфонатах
1.4.2.4. Термическое разложение метилфосфоновой кислоты.
1.4.2.5. Биодеструкция СР связи в фосфонатах.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы.
2.1.1. Реактивы.
2.1.2. Используемые бактериальные штаммы
2.1.3. Питательные среды
2.1.4. Составы растворов
2.1.5. Приборы
2.2. Методы
2.2.1. Трансформация компетентных клеток
2.2.2. Биосинтез фермента ШэОРН.
2.2.3. Биосинтез фермента 1Бь6ОРН.
2.2.4. Получение носителей для металлхслатирующей хроматографии
2.2.5. Получение иммобилизованных препаратов органофосфатгидролазы, модифицированных иолигистидиновыми последовательностями
2.2.6. Электрофоретический анализ белков в ПААГ.
2.2.7. Определение концентрации белка.
2.2.8. Кинетические исследования реакции гидролиза Параоксона, катализируемой ро1уН1заналогами ОРИ в растворимой форме
2.2.9. Кинетические исследования реакции гидролиза Параоксона, катализируемой ро1уН1Баналогами ОРН в иммобилизованной форме.
2.2 Исследование температурного оптимума действия ро1уН1Баиалогов ОРН в растворимой и иммобилизованной формах
2.2 Термоинактивация растворимых и иммобилизованных ро1уН1Баналогов ОРН
2.2 Изучение операционной стабильное ги биокатализагоров на основе иммобилизованных ро1уШБаналогов ОРН.
2.2 Получение и регидратация сухих иммобилизованных препаратов ро1уН1аналогов ОРН.
2.2 Электронная микроскопия криоПААГ.
2.2 Кинетические исследования реакций гидролиза фосфонатов, катализируемых ГЙБбОРН в растворимой форме.
2.2 Кинетические исследования реакций гидролиза фосфонатов, катализируемых Н1БбОРН в иммобилизованной форме в защитном материале.
2.2 Кинетические исследования реакций гидролиза фосфонатов, катализируемых ШвбОРН в иммобилизованной форме в проточной системе.
2.2 Определение концентрации фосфатионов
2.2 Определение концентраций МФК и муравьиной кислоты
2.2 Определение концентрации формальдегида.
2.2 Определение концентрации метана
2.2 Определение концентрации метанола
2.2 Определение концентрации фосфонатов
2.2 Определение концентрации вещества типа Ух
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Белок з2ОРН и его свойства в свободном и иммобилизованном состоянии
3.1.1. Биосинтез и иммобилизация белка ШзОРН.
3.1.2. Влияние и температуры на каталитические характеристики ШбОРИ в растворимой форме
3.1.3. Каталитические характеристики ШяОРН растворимой форме.
3.2. Свойства иммобилизованных биокатализаторов на основе Н1Б,СР и 1НбОРН
3.2.1. рНзависимость активности иммобилизованных биокатализа горов
3.2.2. Влияние температуры па свойства иммобилизованных блокаализаюров
3.2.3. Каталитические характеристики иммобилизованных биокатализаторов в отношении различных субстратов
3.2.4. Стабильность иммобилизованных биокатапизаторов при хранении и периодическом использовании
3.2.5. Получение сухих форм иммобилизованных биокатализаторов
3.2.6. Исследование возможности масштабирования объма иммобилизованного биокатализатора
3.3. Применение растворимой и иммобилизованной форм НЗбОРН в процессе гидролиза фосфонатов.
3.3.1. Растворимая форма НОРН к реакциях гидролиза фосфонатов.
3.3.1.1. Каталитические характеристики гидролиза ИБЭМФК и ДИБЭМФК под действием ПБбОРН.
3.3.1.2. Каталитические характеристики гидролиза МФК под действием НвбОРН .
3.3.1.3. Кинетическая модель процесса ферментативного гидролиза различных ФОС в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Ух.
3.3.1.4. Ферментативный гидролиз ФОБ в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Ух.
3.3.1.5. Ферментативный гидролиз ФОС в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества тина Ух.
3.3.1.6. Механизм реакции гидролиза МФК под действием НвбОРН.
3.3.2. Иммобилизованная НвбОРН в реакциях разложения фосфонатов
3.3.2.1. Иммобилизованная НБбОРН в составе защитного материала.
3.3.2.2. Разложение фосфонатов в проточных системах под действием иммобилизованных биокатапизаторов
ВЫВОДЫ.
Список литерату


Кинетические параметры реакций гидролиза фосфорорганических пестицидов, катализируемых ОРН . Условия С, мМ СНЕБбуфср 9,1, Сосодержащий фермент выделен из клеток Е. СО ОН5ос. Паратион РО 0 0 2. Ух Р8 0. ОРН является метал лзависимым ферментом и содержит два нона металла 7лг или Со2 на каждую субъединицу. В Таб. Кт для фермента, содержащего катионы различных металлов в активном центре, определнные для такого субстрата, как Параоксон диэтил4нитрофенилфосфат, Табл. Из этих данных следует, что Со2содержагций фермент проявляет наибольшую каталитическую активность по отношению к триэфирам ортофосфорной кислоты. Для Си2 данные константы определены не были, однако, по сравнению с Со2содержащим ферментом удельная активность была в раз ниже . Рис. Молекула ОРН с отмеченными 1 и Сконцами белка, а также с выделенным активным центром фермента. Известно влияние различных ионов металлов на и температурный оптимум действия ОРН, а также стабильность фермента . Авторами было показано, что рКа каталитической группы для разных металлов, расположенных в активном центре, имеет разную величину. Так, для фермента, содержащего в активном центре ионы Со2, рКа равно 7, 0,, в случае же и Сссодержащсго фермента рКа составляет 7,0, и 7,0,, соответственно. Авторы объяснили данные результаты тем, что происходят небольшие конформационные изменения в активном центре изза того, что эффективный радиус ионов металлов увеличивается в ряду Сд Со, и ионы Со2 в большей степени деформируют окружение в активном центре. Также было показано, что фермент, содержащий в активном центре ионы Ъ ч проявляет наибольшую термостабильность, что также является следствием наименьшего ионного радиуса. С после мин экспозиции при этой температуре. Таблица 3. Кинетические параморы реакции гидролиза Параоксоиа, катализируемой ОРИ, выделенной из Г1поЬас1епитлр. Условия С. М С НЕБбуфер 9. Е.соИ рКЗЗ. Со1 3,0. Рептгсноструктурный анализ молекул ОРН показал, что шесть остатков i находятся непосредственно вблизи активного центра фермента, а четыре из этих остатков i, i, Ii1 и IIi0 являются лигандами ионов металла в активном центре Рис
Рис. З. Строение активного центра ОРН, образованного при участии ионов 2 Г 2. Два иона металла связаны друг с другом посредством карбамилированного остатка 9. В аиоформе фермента остаток 9 не модифицирован. При помощи 3С ЯМРснекгроскоиии было доказано, что в образовании карбамилированиого остатка принимает участие диоксид углерода Рис. З. Установлено, что высокая концентрация бикарбоната, привнеснная в раствор фермента, ускоряет процесс формирования его активного центра при переходе апоформы в холоформу в присутствии ионов металла . Вторым мостиковым лигандом между ионами металла служит молекула воды. Координационная сфера одного из ионов металла имеет конфигурацию тригональной бипирамиды, а второго осгаэдрическую. Расстояние между ионами металла в активном центре составляет 3,8 А. Важную роль в формировании активного центра ОРН, как оказалось, играет также остаток Азр3 на схеме не представлен, который образует водородную связь с имидазолом остатка 8 в апоформе фермента В холоформе карбоксильная группа Азр3 образует водородную связь с остатком 0, способствуя его оптимальной пространственной ориентации. Помимо функциональных групп фермента, принимающих непосредственное участие в катализе, предполагается существование трх гидрофобных участков, влияющих на связывание субстрата и определяющих, таким образом, специфичность действия фермента . Трхмерное строение активного центра ОРН представлено на Рис. Кроме того, на Рис. ОРН. Нитрофенильная группа представленного субстрата Метилпаратиона располагается в полости, образуемой остатками , Ьеи1, МеЬ7 и РНе6. Одна из метоксигрупп взаимодействует с группой аминокислотных остатков, образованной е0, Ьеи3, РЬе6, Бег8 и Тгр1, другая с областью, содержащей Ьеи1, РЬе2, РЬе6, Тгр1 и Туг9, при этом з4 участвует в поддержании активной конформации фермента . Рис. Трхмерное строение активного центра ОРН в присутствии координированного субстрата Метилпаратиона .