Конформационные особенности молекулы рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы и её активного центра, модифицированных спиновой меткой

• Автор: Муллокандов, Эдуард Ашерович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1985
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ .

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физикохимические свойства рибулозо1,5дифосфаткарбоксилазы .

1.2. Каталитические свойства РДФазы .

1.3. Химическая природа групп активного центра РДФазы

1.4. Особенности метода спиновых меток

1.5. Зависимость параметров спектров ЭПР иминоксильных радикалов от полярности окружения .

1.6. Исследование белков с помощью метода спиновых

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Выделение белка и его модификация спинметкой
2.2. Получение спинмеченых субьединиц рибулозо1,5дифосфаткарбоксилазы
2.3. Методика обработки носителей для иммобилизации
рибулозо1,5дифосфаткарбоксилазы
Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ СПИНМЕЧЕНОЙ РИБУЛ01,5ДЙФ0СФАТ
КАРБОКСИЛАЗЫ .
3.1. Идентификация места присоединения спинметок на молекуле РДФазы
3.2. Анализ спектра ЭПР спинмеченой РДФазы. Измерение времени корреляции макромолекулы РДФазы
3.3 Изменение конформации молекулы РДФазы при взаимодействии с субстратами и активатором
3.3.1. Изменение конформации РДФазы при взаимодействии
с рибулозо1,5дифосфатом РДФ
3.3.2. Изменение конформации молекулы РДФазы при взаимодействии с ЫаНСОд .
3.3.3. Изменение конформации молекулы РДФазы при взаимодействии сМдС2
3.4. Изменение конформации субъединиц РДФазы при взаимодействии с субстратом и его аналогом
3.5. Избирательная модификация групп РДФазы спинметкой
3.5.1. Окисление нитроксильных радикалов на молекуле фермента после удаления восстановителя .
3.5.2. Модификация активного центра РДФазы спинметкой
3.5.3. Модификация РДФазы этилмалеинимидом с последующим спинмечением
Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ РИБУЛ01,5ДИФОСФАТКАРБОКСИЛАЗЫ
ИММОБИЛИЗОВАННОЙ НА НЕОРГАНИЧЕСКИХ НОСИТЕЛЯХ
4.1. Исследование спинмеченой РДФазы иммобилизованной
на силикагеле, активированном глутаровым альдегидом
4.2. Использование иммобилизованных препаратов РДФазы
для поглощения С0 из воздуха .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Был подобран оптимальный носитель и условия для иммобилизации РДФазы и на основе иммобилизованного фермента создана долговременная система очистки воздуха от углекислого газа. Глава . Впервые РДФаза как индивидуальный белок была вьщелена в г. Авторы назвали этот белок белок фракции I,имея ввиду его электрофоретическую гомогенность. Позже было показано, что фермент, карбоксилирующий РДФ в процессе фотосинтеза, и белок фракции I это одно и то же вещество . Рибулозо1,5дифосфаткарбоксилаза катализирует две реакции карбоксилирование рибулозо1,5дифосфата РДФ до двух молекул 3фосфорноглицериновой кислоты 3ФГК и окисление РДФ до одной молекулы фосфоглицерата. Оксигеназная реакция РДФазы была открыта в г. Авторы наблюдали ингибирование карбоксилазной реакции кислородом. Сразу после открытия оксигеназной реакции РДФазы стали высказываться различные предположения о том,как один фермент может выполнять две функциикарбоксилирования и оксигенирования. Большая часть исследователей склоняется к мнению, что обе реакции идут на одном активном центре . Кроме того, бифункциональность фермента может объясняться существованием двух разных ферментов РДФкарбоксилазы и РДФоксигеназы . Однако наличие двух различных ферментов экспериментально не подтвердилось. РДФаза, обнаруженная во всех фотосинтезирующих организмах, имеет большой молекулярный вес и сложную субъединичную структуру. Фермент высших растений имеет молекулярную массу около 0 ООО дальтон. Электронномикроскопическое изучение четвертичной структуры РДФазы показало, что молекула представляет собой куб со стороной приблизительно 0 А0 авторы сделали вывод,что молекула РДФазы состоит из субъединиц . Позже были выделены два типа субъединиц,отличающихся по молекулярному весу . Большие субъединицы имеют молекулярный вес от ООО до ООО дальтон, а малыеот ООО до ООО дальтон. Фермент диссоциирует на субъединицы при воздействии мочевины,додецилсульфата натрия,парахлормеркурибензоата и при значения рНП , . Большие субъединицы обладают ферментативной активностью даже в отсутствие малых субъединиц . Роль малых субъединиц в каталитической реакции РДФазы до сих пор не ясна,однако предполагается, что это только регуляторный центр . Методом светорассеяния было показано, что при удалении малых субъединиц, наряду с резким уменьшением активности наблюдалась тенденция больших субъединиц к образованию агрегатов. Отсюда был сделан вывод о том, что малые субъединицы РДФазы,занимая пространство между большими субъединицами,предохраняют их от агрегации и образования геля . Кроме того, авторы этой работы показали, что отсутствие малых субъединиц изменяет рНоптимум ферментативной реакции, что свидетельствует об их регуляторной функции. РДФазы. На основе результатов анализа данных по малоугловому рассеянию, электронной микроскопии, оптической дифракции и плотности кристаллов, было высказано предположение, что наиболее вероятной структурой макромолекулы РДФазы является агрегат, состоящий из субъединиц 8 больших и 8 малых. В настоящее время такая схема структурной организации РДФазы является общепринятой. Однако, известно, что многие представители низших растений имеют в составе РДФазы только большие субъединицы ,. Считается , что малые субъединицы появились в процессе эволюции. Аминокислотный состав больших субъединиц белка из различных растений идентичен ,, но резко отличается от малых субъединиц даже из одного вида растений. Также совершенно непохожи аминокислотные составы малых субъединиц РДФазы из разных видов растений . Ферменты, обладающие оксигеназной активностью,как правило, содержат атом металла 9. В очищенных препаратах РДФазы обнаружено до I грамматома меди , также было показано, что раствор фермента дает типичный спектр ЭПР Си . Однако, присутствие или отсутствие меди никак не влияет на кинетические или структурные свойства фермента . Таким образом, вопрос о природе оксигеназной реакции РДФазы остается открытым. Каталитические свойства РДФазы. Кинетика реакций, катализируемых РДФазой, зависит от порядка добавления реагентов, участвующих в ферментативной реакции ,,.