Определение и анализ пространственной структуры рибосомного белка L1 из бактерии Thermus thermophilus в комплексе с фрагментом матричной РНК при разрешении 2,6Å

• Автор: Волчков, Сергей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 90 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ.2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНА ЧЕНИ И

Введение.

Глава 1. Обзор литературных данных.

1.1.Основные методы рентгеноструктурного анализа макромолекул.

1.2. Молекулярное замещение.

1.2.1. Метод максимального правдоподобия и его применение в задачах молекулярного замещения.

1.2.1.1. Правдоподобие функции вращения.

1.2.1.2. Функция правдоподобия для трансляции.

1.2.1.3. Усиленные функции правдоподобия

1.2.1.4. программа для решения задач молекулярного замещения методом максимизации правдоподобия
1.3 Уточнение структуры макромолекул
1.3.1. Проблема переопределенное задачи кристаллографического уточнения.
1.3.2. Уточнение с ограничениями i и i.
1.3.3. Достоверность кристаллографического уточнения
1.3.4. Критерии оценки качества атомной модели
1.3.4.1. Стандартный кристаллографический фактор
1.3.4.2. как критерий оценки качества модели в процессе уточнения.
1.3.5. Улучшение фаз методом модификации плотности с
использованиемсотр1е1е vii.
1.3.6 Уточнение максимизацией правдоподобия.
1.3.7. Схемы и программы уточнения
1.3.7.1. Программа .
Глава 2.Экспериментальная часть.
2.1. Общая характеристика комплекса рибосомного белка 1 с фрагментом мРНК.
2.2. Получение и кристаллизация комплекса мРПК
2.3. Сбор и анализ дифракционных данных.
2.4. Решение фазовой проблемы и построение модели.
2.4.1. Построение стартовой поисковой модели
2.4.2. Позиционирование модели в независимой части элементарной ячейки и расчет фаз.
2.4.3. Построение и уточнение модели

Глава 3. Результаты и обсуждение .
3.1. Общая характеристика кристаллической структуры комплекса ТШЛмРНК
3.1.1. Структура рибосомного белка ТАЫ в комплексе ТАЫмРНК
3.1.2. Структура нуклеотидного фрагмента мРНК в комплексе ТЛЫмРНК.
3.1.3. РНКбелковые взаимодействия в составе комплекса ТЙ1ЫмРНК.
3.2. Сравнительный анализ структуры комплекса ТШЫмРНК и известных структур белка Ы в РНКсвязанном и свободном состояниях
3.2.1. Сравнение структур белка ТШЫ в связанном с мРНК и свободном состоянии
3.2.2. Сравнение структуры белка Ы из комплекса ТЫмРНК с известными структурами белка Ы из различных организмов.
3.2.3. Две конформации белка ТШЫ. Белок ТШЫ должен принять открытую конформацию, чтобы связаться с РНК
3.2.4. Сравнение регуляторных и рибосомного комплексов
Основные результаты и выводы.
Список литературы


Полагают, что для ряда рибосомных белков этот регуляторный связывающий участок на мРНК структурно подобен соответствующему участку связывания белкарепрессора на рРНК. Сродство белка к рРНК больше, чем к мРНК, что позволяет использовать механизм конкурентного связывания для регуляции синтеза белков данного оперона. Исследования, посвященные выявлению деталей механизмов регуляции синтеза на уровне трансляции, интенсивно ведутся в течение достаточно длительного времени. Несмотря на то, что накоплен большой объем информации, полученной, в основном, биохимическими и генетическими методами, структурные детали этого механизма пока изучены плохо. Ранее были получены только структуры некоторых рибосомных белковрегуляторов в комплексе с фрагментами рибосомной РНК 9, , , и в составе структуры рибосомы. Но поскольку конкурентный механизм регуляции синтеза основан на различии в сродстве белкарепрессора к рРНК и мРНК, для выяснения структурных основ регуляции необходимо также получение структуры комплекса этих белков с фрагментами мРНК. Целью данной работы было получение кристаллической структуры комплекса рибосомного белка Ы из экстремальнотермофильной бактерии ТИегтиБ ЖегторНИш со специфически связывающимся нуклеотидиым фрагментом мРНК из археи уапмеШ, анализ взаимодействия компонентов комплекса и выявление структурных основ механизма регуляции синтеза этого белка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Обзор литературы посвящен современным методам кристаллографии макромолекул. Подробно описаны метод молекулярного замещения, который использовался для определения структуры данного комплекса, последние достижения в усовершенствовании этого метода, а также вычислительные методы, алгоритмы и программы, использующиеся для уточнения структуры макромолекул. В экспериментальной части дано описание условий получения кристаллов комплекса ТЛЫмРНК и сбора дифракционных данных, подробно описано решение фазовой проблемы, представлены результаты кристаллографического уточнения исследуемой структуры. В заключительной главе изложены структурные результаты работы. Подробно описаны структуры компонентов комплекса и результаты анализа их взаимодействия. Проведен сравнительный анализ полученной структуры и определенных ранее структур белка Ы в изолированном состоянии и в комплексах с РНК. На основании этого анализа выдвинуто предположение об определяющей роли домена II белка Ы в регуляции экспрессии генов своего оперона. Глава 1. Ы.Основные методы рентгеноструктурного анализа макромолекул. Первым этапом определения структуры макромолекулы методом рентгеноструюурного анализа является выращивание кристаллов исследуемого объекта и получение картины рассеяния дифракционной картины рентгеновского излучения на полученных кристаллах. Регистрируемая дифракционная картина, является, в основном, результатом когерентного рассеяния фотонов на электронах и напрямую связана с распределением электронной плотности в элементарной ячейке кристалла. Поэтому на втором этапе ищут функцию, описывающую распределение электронной плотности в кристалле исследуемого объекта. На третьем, конечном, этапе осуществляется построение и уточнение модели исследуемой макромолекулы. При поиске функции распределения электронной плотности исследователю приходится решать так называемую фазовую проблему. Суть ее в следующем. X X ЦМехр2яЦ. Лоо V объем элементарной ячейки, ИХ1 целочисленные индексы, определяющие положение дифракционных максимумов в пространстве индексы Миллера. Комплексный коэффициент Ик1 называется структурным фактором и может быть представлен в виде Ик1 гМехррш, где ДМ модуль стругаурного фактора, а рш фаза. Регистрируемая дифракционная картина позволяет измерить интенсивности дифракционных максимумов и вычислить только значения модулей ДМ структурных факторов. Вся информация о фазах рщ теряется. Определение значений фаз структурных факторов для расчета распределения 1 является центральной проблемой кристаллографии.