Участие АТФ-рецепторов в восприятии клетками неспецифических физических и химических воздействий

• Автор: Ли, Вячеслав Вячеславович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 98 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Пуринсргичсскис рецепторы.

1.1. Классификация пуринорецепторов.

1.2. Р2Х рецепторы.

1.3. РгУ рецепторы.

1.4. Система передачи сигнала с Р2У рецепторов.

1.5. Механизмы десенситизации рецепторов.

1.6. Внутриклеточный и ЫаНобменник.

1.7. Изменение объема клеток при активации пуринорецепторов.

2. Функции экстраклеточной АТФ.

2.1. Участие АТФ в синаптической передаче сигнала.
2.2.Участие АТФ в апоптозе.
2.3. Участие пуринорецепторов в изменение формы и агрегации тромбоцитов.
2.4. Участие АТФ в активации и усилении секреции.
2.4.1. Са2зависимая секреция.
2.4.2. Участие различных каналов в секреции.
2.4.3. Механизмы регуляции секреции.
3. Механизмы освобождения АТФ.
3.1. АТФпроницаемые каналы.
3.2. Транспортеры адениновых нуклеотидов.
3.3 Освобождение АТФ посредством экзоцитоза.
4. Освобождение АТФ при различных физических и химических
воздействиях
4.1. Освобождение клетками АТФ при рецепторзанисимой активации.
4.2. Освобождение АТФ при гипотоническом набухании.
4.3. Освобождение АТФ при механической стимуляции.
4.4. Освобождение АТФ при ранении и гипоксии.
4.5. Освобождение АТФ при действии сапонинов.
4.6. Освобождение АТФ при воздействии ингибиторов КМ.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Получение клеток.
2.2. Измерение Са2.
2.3. Измерение светорассеяния клеток.
2.4. Измерения АТФ с использованием люциферинлюциферазной реакции.
2.5. Измерение процесса секреции с использованием акридинового оранжевого
методом флуоресцентной микроскопии.
2. 6. Используемые среды.
2.7. Используемые реактивы.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Метод малоуглового светорассеяния.
1.1. Зависимость интенсивности светорассеяния от концентрации клеток АКЭ.
1.2. Изменение светорассеяния при набухании клеток.
1.3. Изменение светорассеяния при агрегации клеток.
1.4. Математический анализ данных.
2. Изменение светорассеяния н Са2 сигнал в клетках АКЭ при действии АТФ, сапонина, и ингибитора кал модул и к а К1.
2.1. Активация АТФрецептора вызывает кратковременный Са2 сигнал
и обратимое изменение светорассеяния в клетках АКЭ.
2.2. Гексокиназа и сурамин подавляют Са2 сигнал и сокращение
клеток в ответ на АТФ.
2.3. Гексокиназа и сурамин ингибируют РВД при гипотоническом набухании.
2.4. Сапонин вызывает кратковременный Са2 сигнал и обратимое изменение светорассеяния в клетках АКЭ.
2.5. Гексокиназа и сурамин снимают Са2 сигнал и сокращение клеток
в ответ на сапонин.
2.6. Гексокиназа и сурамин подавляют Са2 сигнал и изменение светорассеяния клеток при изменении среды.
2.7. Иономицин вызывает изменения концентрации Са2, и изменения светорассеянии, которые ингибируются гексокиназой.
2.8. Ингибитор калмолулина 7 вызывает мобилизацию Са2 изменение светорассеяния, которые так же ингибируются гексокиназой и сурамином.
3. 1 индуцирует кратковременный вход Са в клетки.
3.1. Вход Са2 и изменения светорассеяния, активируемые 1, ингибируются нордиидро1уаретиковой кислотой ЕИЗА и дигидрокверцетином.
4. Измерение уровня АТФ при помощи люциферинлюциферазной реакции.
5. Освобождение акридинового оранжевого при действии АТФ, сапонина и 7.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Затем было получено большое количество экспериментальных доказательств, указывающих на то, что АТФ играет важную роль во многих других биологических клеточных процессах. В частности, было показано, чго АТФ и другие адениновые нуклеотиды являются регуляторами таких клеточных процессов, как рост и дифференциация клеток, клеточная смерть, высвобождение гормонов, нейротраисмиггеров и цитокинов vi V. Различные биологические ответы на АТФ опосредуются различными рецепторами, находящимися на поверхности клеток, которые активируются при связывании с АТФ или другими нуклеотидами. Физиологическая функция этих рецепторов мало изучена В последние годы явно возросло внимание к пуринорецепторам, их функциям и механизмам освобождения пуринов из клеток. Это связано с обнаружением пуринорецепторов на разных типах клеток включая эндотелиальные, эпителиальные, эндокринные, костные, иммунные, опухолевые клетки, клетки поджелудочной железы и печени, и участием этих рецепторов в контроле их многочисленных функций. АТФ занимает особое место в инициации, усилении и развитии секреции, поскольку она часто входит в состав сскретируемых гранул, а ей выход и взаимодействие с пуринорецепторами на поверхности клеток может генерировать дополнительный Са2 сигнал и активировать секрецию. В настоящее время иоказано, что АТФ, наряду с классическими трансмиттерами, нейропептидами и окисью азота, является котрансмиттсром в периферической и центральной нервной системе. Освобождение АТФ из клеток и его использование в качестве агониста пуринорецепторов происходит при активации рядом гормонов, факторами роста, инсулином, стимуляторами митогенеза, секреции и хемотаксиса многих клеток, включая лимфоциты, макрофаги i, М. Р. . Количество освобождаемой АТФ сильно различается между клеточными линиями. Для обеспечения освобождения АТФ наиболее вероятен механизм экзоцитоза. Нейроны, хромаффинные и секреторные клетки контролируют освобождение АТФ, нейротрансмиттеров и других экстраклеточных медиаторов после упаковки в специализированные гранулы, называемые синаптическими везикулами и хромаффинными гранулами v, . Большинство сообщений об индукции секреции АТФ связано с активацией клеток агонистами рецепторов v, . Однако АТФ может освобождаться и при воздействии неспецифических физических и химических факторов, при ранении и гипоксии vi V. Набухание многих клеток в гипотонических условиях вызывает выброс АТФ, которая рецепторзависимо принимает участие в регуляции объема клеток посредством механизма, известного как регуляторное изменение объма, или V v и, таким образом, выступает в качестве аутокринного регулятора клеточного объема в гипотонических условиях , . Ранее в нашей лаборатории было показано, что сапонин в низких концентрациях КГ 3 не индуцирует неспецифической проницаемости мембран, а вызывает генерацию Са сигнала мобилизуя ионы Са из эндоплазматического ретикулума ЭР и активирует вход Са2 снаружи в клетках асцитной карциномы Эрлиха iv , . Механизм такой активации до сих пор не изучен. Возможно, что при действии сапонина также происходит секреция АТФ. Но сам механизм освобождения АТФ до сих пор нсвыяснсн. Давно известны несколько феноменов связанных с так называемым парадоксом, природа которых до настоящего времени не выяснена. Нами был открыт феномен активации Са2 сигнализации при сдвиге среды в щелочную область на клетках АКЭ. Показано, что сдвиг на сд. Рз и мобилизации Са . Мы предполагаем, иго в генерации данного Са2 сигнала также принимает участие освобождающаяся АТФ. Также известно, что ингибиторы калмодулина КМ стимулируют секрецию АТФ в тромбоцитах человека А, , секрецию инсулина и АТФ из клеток поджелудочной железы i Н, и секрецию ренина из клеток почки . Молекулярный механизм участия КМ в регуляции секреции не известен. Роль КМ в регуляции цитозольного Са2 также остается в большой степени не известной. Ингибиторы КМ повышают уровень внутриклеточного Са2, подавляя Са2 АТФазу плазматической мембраны, активируя мобилизацию из внутриклеточных структур и вход Са2 снаружи Н, .