Термодинамические и кинетические параметры взаимодействия транспортной РНК с А сайтом 70S рибосомы Escherichia coli: роль 37 нуклеотида

• Автор: Коневега, Андрей Леонидович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 134 с. : ил.

1.1. Введение

1.2. Декодирование генетической информации на рибосоме.

1.2.1. Цикл элонгации

1.2.2. Селективность взаимодействия

1.2.3. Кинетическая схема взаимодействия аминоацилтРНК с А сайтом

1.2.4. Механизм взаимодействия аатРНК с А сайтом

1.2.5. Точность декодирования. Стабилизация кодонантикодонового взаимодействия и механизм индуцированного соответствия

1.3. Строение бактериальных рибосом

1.3.1. Пространственная структура бактериальных рибосом

1.3.2. Структурные исследования декодирующего центра.

1.3.3. Конформационные изменения декодирующего центра субчастицы

1.4. Структура транспортной РНК.
1.4.1. Модифицированные нуклеотиды тРНК
1.5. Методы получения препаративных количеств мутантных тРНК для биофизических и биохимических исследований.
1.6. Влияние модификаций нуклеотида тРНК на кодонантикодоновое взаимодействие
1.6.1. Упрощенные модельные системы без рибосом
1.6.2. Взаимодействие между двумя тРНК с комплементарными антикодонами как модель кодонантикодонового взаимодействия
1.6.3. Взаимодействие антикодоновых шпилек тРНК с рибосомами.
1.6.4. Взаимодействие тРНК с рибосомами
1.7. Использование немодифицированных транскриптов для изучения структурнофункциональных особенностей тРНКр1е.
1.8. Заключение. Задачи данного исследования
Глава 2. Материалы и методы.
2.1. Материалы
2.2. Приборы и оборудование.
2.3. Сайтнаправленный мутагенез
2.4. Приготовление матричной ДНК для транскрипции i vi
2.5. Выделение РНКполимеразы бактериофага Т7.
2.6. Получение немодифицированных транскрилтов тРНК.
2 7 Получение препарата частично обогащенных аминоацилтРНКсинтетаз
2.8. Хроматографический анализ препаратов тРНК
2.9. Получение дрожжевой тРНКр1в с отщепленным основанием
2 Получение инициаторной .
2 Получение аминоацилированных 4i
2 Выделение рибосом ii i
2 Измерения радиоактивности.
2 Измерение количества тРНК, связанной с рибосомами.
2 Получение инициаторных рибосомных комплексов
2 Формирование тройного комплекса .
2 Получение лретранслокационных рибосомных комплексов.
2 Изучение стабильности пептидилтРНК в А сайте рибосом.
2 Обработка кинетических кривых и вычисления
2 Методы изучения кинетики переходных процессов.
2 Изучение взаимодействия тРНК с взаимно комплементарными антикодонами.
2 Анализ престационарной кинетики реакции образования дипептида.
2 Анализ престационарной кинетики реакции гидролиза .
Глава 3. Изучение взаимодействия пептидилтРНК с А сайтом
рибосомы.
3.1. Введение мутаций в ген дрожжевой фенилаланиновой тРНК
3.2. Получение с заменами в положении.
3.3. Выбор модельной системы
3.4. Природа нуклеотида тРНК влияет на стабильность пепттРНК в А сайте рибосомы.
3.5. Обратимость диссоциации пептидилтРНК из А сайта рибосомы.
3.6. Термодинамические параметры взаимодействия пептидилтРНК с А сайтом
рибосомы
3.7. Роль ионов Мд7 во взаимодействии пепттРНК с А сайтом рибосомы
3.8. Влияние паромомицина на взаимодействие пепттРНК с А сайтом рибосомы.
3.9. Роль ионов Мдг в кодонантикодоновом взаимодействии вне рибосомы
3 Кинетика взаимодействия пепттРНК с А сайтом
3 Обсуждение
Глава 4. Взаимодействие аминоацилтРНК с А сайтом рибосом . i. Влияние нуклеотида тРНК на кинетические параметры Асайтового связывания 5
4.1. Экспериментальные подходы к изучению лрестационарной кинетики и выбор условий проведения экспериментов5
4.2. Определение кинетических параметров реакции гидролиза фактором элонгации .7
4.3. Определение кинетических параметров реакции синтеза дипептида
4.4. Обсуждение
Общие выводы. 0
Список работ, опубликованных по теме диссертации.1
Список литературы


Использованные методы престационарной кинетики позволяют определить константы скоростей реакций взаимодействия аатРНК с А сайтом и определить лимитирующую роль реакции гидролиза для химерных видов тРНКРЫ
Список сокращений. РНК i . Рибосомы и их субчастицы. ПЦР полимеразная цепная реакция. Спектрофотометрические параметры. Ао количество вещества, которое при растворении в 1 мл растворителя создает в последнем оптическую плотность . Глава 1. Обзор литературы. Введение. Трансляция последовательности мРНК в полипептидную цепь, происходящая на рибосомах, является важнейшим этапом реализации генетической информации. В бактериальной клетке содержатся около видов различных аминоацилтРНК в основном, в виде тройного комплекса с фактором элонгации и . Задача рибосомы в каждом раунде удлинения полипептида заключается в отборе тРНК, антикодон которой комплементарен кодону мРНК, установленному в Асайтовом участке декодирующего центра. Очевидно, что необходимым условием жизнеспособности организма является обеспечение безошибочного синтеза белков. Если принять, что средний размер белковой молекулы составляет 0 аминокислотных остатков, а вероятность миссенсошибки ошибочного включения аминокислоты в любом положении составляет 3, то можно ожидать, что лишь полипептидов будет синтезировано без ошибок 1. В бактериях измеренная частота аминокислотных замен на внутренних кодонах варьирует от 4 до 2,3. В эукариотических клетках получены близкие значения частоты ошибок от 5 дрожжи до ЮЮ3 в клетках высших эукариот 2,3. Низкий уровень миссенсошибок трансляции, измеренный i viv, невозможно объяснить с позиций термодинамики, исходя из разницы в значениях свободной энергии кодонантикодонового взаимодействия для полностью комплементарных пар тринуклеотидов и пар, имеющих неспаренные основания в одном из трех положений. Различия в свободной энергии комплекса, определяемые отсутствием водородных связей, весьма невелики ккалмоль, поэтому частота ошибки должна достигать значения 2 т. Кроме того, высокая скорость трансляции i viv а. Таким образом, даже для достижения частоты ошибки 2. РНКмРНК, либо использовать заложенный потенциал селективности повторно. В дальнейших разделах мы рассмотрим основные известные на сегодняшний момент и предполагаемые пути повышения селективности отбора корректных кодонантикодоновых дуплексов рибосомой и стабилизации кодонантикодонового комплекса как за счет его взаимодействия с элементами декодирующего центра рибосомы, так и за счет консервативных структурных элементов молекулы тРНК. Декодирование генетической информации на рибосоме. Цикл элонгации. Полный цикл элонгации при синтезе полипептида на рибосоме состоит из трех основных этапов рис. Началом цикла принято считать функциональное состояние рибосомы, в котором пептидилтРНК или инициаторная аатРНК связана в Р сайте, а в А сайте экспонирован свободный участок мРНК следующий кодон . Рис. Схема полного цикла элонгации при синтезе полипептида. Показаны три основных функциональных состояния рибосомы и удлинение полипептидной цепи. Во время первого этапа трехкомпонентный комплекс, состоящий из фактора элонгации ЕРТи, молекулы ОТР и аминоацилтРНК аатРНК, связывается в Асайтовом участке рибосомы. Связывание является кодонзависимым, т. А сайте кодона мРНК и антикодона тРНК. При успешном осуществлении кодонантикодонового узнавания, происходит активация ГТФазной активности фактора ЕРТи, гидролиз молекулы ОТР и аминоацилтРНК устанавливается в А сайте рибосомы, в то время как фактор элонгации ЕРТи диссоциирует из рибосомы 8,9. После успешного завершения этапа доставки аатРНК в А сайт происходит вторая реакция цикла элонгации реакция транспептидации , катализируемая пептидилтрансферазным центром рибосомы, и пептидильный остаток переносится на аминогруппу молекулы аатРНК. При этом происходит удлинение полипептидной цепи на 1 аминокислотный остаток. Таким образом, в Р сайте остается деацилированная тРНК, а в А сайте оказывается пептидилтРНК. Третьим этапом является реакция транслокации катализируемая фактором элонгации ЕРв , при этом деацилированная тРНК из Р сайта рибосомы перемещается в Е сайт откуда затем диссоциирует в раствор, а пептидилтРНК вместе со связанным с ней кодоном мРНК перемещается в Р сайт.