Исследование электронно-возбужденных состояний эмиттера бактериальной биолюминесценции с помощью молекулярных акцепторов энергии

• Автор: Немцева, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 118 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Миграция энергии электронного возбуждения в бактериальных

биолюминесцентных системах обзор литературы

1.1. Механизм бактериальной биолюминесценции

1.1.1. Общая характеристика явления.

1.1.2. Биолюминесцентная реакция бактерий

1.1.2.1. Интермедиаты реакции, катализируемой бактериальной люциферазой.

1.1.2.1. Проблема эмиттера бактериальной биолюминесценции

1.1.2.1.1. Проблема формирования первичного эмиттера биолюминесценции

1.1.2.2.2. Проблема переноса энергии на вторичные эмиттеры бактериальной биолюминесценции
1.1.3. Пути воздействия химических соединений
на биолюминесценцию i vi.
1.2.Современные методы исследования межмолекулярных переносов энергии.
1.2.1. Дезактивация электронновозбужденных состояний молекул
1.2.2. Тушение флуоресценции.
1.2.3. Переносы энергии электронного возбуждения.
1.2.3.1. Излучательный тип переноса энергии
1.2.3.2. Теория безызлучательного переноса энергии.
1.2.4. Флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением
1.3. Спектральнолюминесцентные свойства компонентов биолюминесцентных
бактериальных систем
1.3.1. Спектральные свойства ферментов бактериальной биолюминесценции
1.3.2. Свойства флавинмононуклеотида и его производных.
1.3.3. Спектральные свойства НАД и НАДН.
1.3.4. Оптические свойства альдегидов
1.3.5.Спектральные свойства люмазинового и желтого флуоресцентного белков.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ГЛАВЕ 1.
Глава 2. Материалы и методы.
2.1. Реактивы
2.2. Экспериментальные установки.
2.2.1. Регистрация люминесценции при стационарном возбуждении
2.2.2. Измерение флуоресценции с временным разрешением.
2.2.3. Прочие вспомогательные измерения
2.3. Методика эксперимента.
2.3.1. Регистрация спектров.
2.3.2. Измерения с временным разрешением.
2.4. Методика обработки результатов измерений
2.4.1. Разделение спектров биолюминесценции и сенсибилизированной люминесценции красителей
2.4.2. Обработка кривых спада флуоресценции и анизотропии
Глава 3. Сенсибилизированная люминесценция молекул в биолюминесцентной
системе.
3.1. Влияние условий эксперимента на форму спектра биолюминесценции
3.2. Перенос энергии возбуждения а ксантеновые красители.
3.2.1. Свойства ксантеноеых красителей.
3.2.2. Влияние красителей на форму спектра биолюминесценции
3.2.3.Тушение биолюмнесценции красителями
3.2.4. Люминесценция красителей в биолюминесцентной системе
З.З.Тестирование энергии высоковозбужденных состояний в
биолюминесценции
3.3.1.Спектры биолюминесценции в присутствии ароматических соединений
3.3.2. Оценка зклада возможного перекрытия спектров биолюминесценции и поглощения МСБ.
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 3
Глава 4. Взаимодействие экзогенных молекул с бактериальной люциферазой
4.1. Изменение спектров флуоресценции молекул в присутствии люциферазы.
4.1.1. Спектры гидрофобных молекул
4.1.2. Спектры ксантеновых красителей в реакционной смеси.
4.2. Спад анизотропии флуоресценции ароматических соединений
4.2.1. Анизотропия экзогенных молекул.
4.2.2. Анизотропия флуоресценции люциферазы.
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 4
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ ПО ДИССЕРТАЦИИ
ЛИТЕРАТУРА


Полученные результаты указывают на необходимость учета спектральных характеристик излучения в биолюминесцентном анализе образцов, содержащих флуоресцентные соединения. Это позволяет увеличить чувствительность и точность биолюминесцеитных биотестов в отношении некоторых классов поллютаптов. Спектральные характеристики биолюминесценции интенсивность, положение максимума, форма спектра в присутствии флуоресцентных соединений определяются спектральнолюминесцентными свойствами этих соединений квантовый выход, молярная экстинкция, энергия флуоресцентного состояния. В реакции бактериальной люциферазы происходит образование высоковозбужденного предшественника эмиттера биолюминесценции с энергией электронновозбужденного состояния не менее 0 см Гидрофобные взаимодействия обеспечивают возможность переноса энергии между активным центром люциферазы и малополярными экзогенными молекулами в условиях отсутствия перекрытия спектров. АПРОБАЦИЯ работы. Результаты работы были представлены на 8м Всероссийском с международным участием симпозиуме Гомеостаз и окружающая среда Красноярск, , 8м Международном конгрессе по биотехнологии Будапешт. Международных симпозиумах по биолюминесценции и хемлюминесценции Колония, Италия. Кембридж, Великобритания, , 2м Съезде биофизиков России Москва, , м Международном биофизическом конгрессе Нью Дели, Индия. Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков Минск. Япония, , й Международной конференции по фотохимии Москва. Публикации. Материалы диссертации опубликованы в виде 6ти статей и 7ми тезисов. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав и заключения. Объем диссертационной работы составляет 8 страниц машинописного текста, включая таблиц и рисунка. Работа выполнена в лаборатории фотобиологии Института биофизики Сибирского отделения РАН. Финансовая поддержка разных этапов исследования осуществлялась Министерством образования Российской Федерации и Американского фонда гражданских исследований и развития для независимых государств бывшего Советского Союза, грант ЯЕС2. Фундаментальные исследования и высшее образование Российским фондом фундаментальных исследований гранты 4 и 3 Федеральной целевой программой Интеграция высшего образования и фундаментальной науки проекты А и Б 1МТАБ грант Нидерландской организацией научных исследований ЫУО Красноярским краевым фондом науки проект 5Р. Глава 1. В основе люминесценции организмов лежат хемилюминесцентные реакции, катализируемые специфическими ферментами. По определению, хемилюминесценция это явление, при котором энергия, выделяющаяся в ходе химической реакции, трансформируется в электронновозбужденное состояние одного из продуктов этой реакции Васильев, МсСарга, . Жизнедеятельность организмов всегда сопровождается слабой и сверхслабой хемилюминесценцией Баскаков. Воейков. Теренин, . Это объясняется тем, что процессы окисления органических соединений, являющиеся химической основой дыхания живых систем, связаны с образованием электронновозбужденных состояний. А потому выделение энергии при химических и биохимических процессах в виде света при реакциях окисления или рекомбинации радикалов не столь редкое явление. Однако в большинстве случаев квантовый выход хемилюминесценции не превышает десятых или тысячных долей процента Баскаков, Воейков, . Особенностью биолюминесцентных систем является высокий квантовый выход от 1 до 0 и обязательное участие в реакции белковых компонент специфических белков, которые выступают либо в роли матрицы, связанной ковалентно или нековалентно с небелковым излучающим хромофором, либо в роли биокатализатора, без которого образование электронновозбужденного продукта реакции оказывается невозможным Угарова и др. Высокие квантовые выходы в биолюминесценции связаны с образованием промежуточных продуктов в форме ферментсубстратных комплексов интермедиатов, которые оказываются защищенными от различного рода процессов переноса и превращения энергии, снижающих квантовые выходы Угарова и др. i, МсСарга, .