Влияние карнозина на гликоокислительную модификацию актина скелетных мышц

• Автор: Залесова, Зоя Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.02, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 162 с. : ил

1.1. Функциональная роль карнозина в скелетной мускулатуре

1.1.1. Роль гистидинсодержащих дипептидов в функции мышц и феномен Северина

1.1.2. Механизмы действия гистидинсодержащих дипептидов на работоспособность мышцы.

1.2. Актин как основной сократительный и цитоскелетный белок

1.2.1. Структура молекулы актина

1.2.2. Участие актина в сокращении мышц и подвижности немышечных клеток

1.3. Взаимодействие актина с белковыми компонентами

мышечной клетки.

1.3.1. Взаимодействие актина с белкамимодуляторами его функциональной активности.

1.3.2. Взаимодействие актина с гликолитическими ферментами как способ регуляции интенсивности процесса гликолиза в мышечных клетках
1.3.3. Модуляция взаимодействия гликолитических ферментов с актином при длительной мышечной работе
и ее возможные причины.
1.4. Взаимодействие актина с низкомолекулярными компонентами
мышечной клетки.
1.4.1. Взаимодействие актина с лигандами в условиях нормального функционирования мышечной клетки
1.4.2. Процесс проникновения глюкозы в клетку.
1.4.3. Изменения, происходящие в мышечной клетке
при длительной физической работе
1.4.4. Внутриклеточные процессы, происходящие
при патологических состояниях, связанных с повышением в тканях концентрации глюкозы и свободных радикалов, и нормальном старении организма.
1.4.4.1. Биохимическая природа процесса гликоокисления
1.4.4.2. Гликоокисление белков при диабете
1.4.4.3. Гликоокисление белков и старение организма.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Получение актина из скелетных мышц кролика и крысы.
2.2. Получение актомиозина и миозина из скелетных мышц кролика и
актомиозина из скелетных мышц и гепатоцитов крысы.
2.3. Получение суммарной фракции гистонов из ядер гепатоцитов крысы . .
2.4. Получение теней эритроцитов
2.5. Метод определения собственной АТФазной активности теней эритроцитов.
2.6. Измерение концентрации белка по методу Лоури.
2.7. Измерение концентрации белка микробиуретовым методом.
2.8. Обработка актина модифицирующими веществами
2.9. Метод определения степени гликирования белков сыворотки крови с использованием тетразолия нитросинего.
2 Электрофорез в полиакриламидном геле с 8 М мочевиной как метод идентификации продуктов гликоокисления в актине.
2 Электрофорез в полиакриламидном г еле с додецилсульфатом натрия как метод идентификации высокомолекулярных конечных продуктов глубокого гликирования и
окислительного расщепления в актине.
2 Вестернблоттинг с применением моноклональных антител к актину как метод идентификации продуктов деградации
молекулы белка
2 Флуориметрический метод для количественной оценки
содержания конечных продуктов глубокого гликирования в актине . .
2 Метод оценки содержания свободных аминогрупп в белках
2 Флуориметрический метод для оценки способности Гактина к полимеризации.
2 Флуориметрический метод для количественной оценки содержания битирозиновых сшивок в актине.
2 Метод определения АТФазной активности миозина и степени активации ее актином
2 Определение активности фосфофруктокиназы как метод оценки степени ее связывания с актином.
2 Выделение, очистка и кристаллизация альдолазы из скелетных мышц кролика.
2 Определение активности альдолазы как метод оценки степени ее связывания с актином
2 Метод определения степени ингибирования дезоксирибонуклеазы I актином.
2 Статистическая обработка данных
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Влияние карнозина на проявление функциональных свойств
актина i vi
3.2. Влияние карнозина на модификацию i viv внутриклеточных
белков крыс с экспериментальной галактоземией.
3.2.1. Оценка гипергликемического состояния организма по содержанию фруктозамииов в белках сыворотки крови.
3.2.2. Оценка модификации актина скелетных мышц по степени активации им аденозинтрифосфагазы стандартизированного препарата миозина в присутствии
3.2.3. Оценка изменения структурных параметров
актина скелетных мышц.
3.2.4. Влияние карнозина на содержание свободных МЬЬгрупп в актомиозине скелетных мышц и клеток печени
3.3. Оценка возможности изменения функциональных свойств
актина эритроцитов при диабете.
3.4. Выбор оптимальных условий изучения влияния карнозина на
процесс гликоокислеиия актина i vi.
3.5. Влияние карнозина на модификацию актина в Гформе
при инкубации с глицеральдегидом.
3.5.1. Оценка влияния карнозина на изменение структурных параметров Гактина
3.5.2. Сравнительная оценка влияния карнозина и аминогуаиидипа на изменение способности актина активировать 2 3 стандартизированного препарата миозина.
3.6. Влияние карнозина на модификацию актина в Фформе
при инкубации с глицеральдегидом.
3.6.1. Оценка влияния карнозина на изменение степени
связывания актином альдолазы.
3.6.2. Сравнительная оценка влияния карнозина и аминогуанидина на изменение способности Фактина активировать
АТФазу стандартизированного препарата миозина
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АДФ аденозиндифосфорная кислота АТФ аденозинтрифосфорная кислота Гактин глобулярная форма актина ГСД гистидинсодержащие дипептиды ДМФ 1 морфолино1 дезоксиОфруктозамин ДК дезоксирибонуклеиновая кислота ДТТ дитиотрейтол
ИЗСД инсулинзависимый сахарный диабет
ИНСД инсулиннезависимый сахарный диабет
КПП конечные продукты глубокого гликирования
М моль
мМ миллимоль
Мср среднее арифметическое
СТ тетразолий нитросиний
ТЕМЕД тетраметилэтилендиам и н
ТНБС тринитробензолсульфонат
Трис трисгидроксиметиламинометан
Фактин фибриллярная форма актина
ФФК фосфофруктокиназа
ЭГТА этилендиоксидиэтилендинитрилогетрауксусная кислота
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
конечные продукты глубокого пикирования
ЬГкарбоксиметиллизин
трансмембранный белокпереносчик глюкозы
Ы2ГидроксиэтилпиперазинЫ2этансульфоновая кислота
никотинамидадениндинуклеотид
фенилметансульфонилфторид
ВВЕДЕНИЕ


Действительно, присутствие карнозина может препятствовать формированию в клетках продуктов Амадори, образуемых при перегруппировках оснований Шиффа, означающих прохождение начального
этапа гликирования, а также и поперечных сшивок между макромолекулами. Подобный эффект карнозина проявляется при его высоких концентрациях мМ, таких в которых этот дипсптид содержится в нервной и мышечной тканях Хипкис, . Остается неясным, на защиту каких белковых компонентов этих тканей направлено действие карнозина. В связи с этим цель работы состоит в исследовании антиоксидантного и антигликирующего влияния карнозина на функционирование основного сократительного и цитоскелетного белка актина i viv и i vi. Г и Фактина известного антигликирующего агента аминогуанидина. Изменение этих функциональных свойств сопоставляли со степенью модификации белка, которую оценивали как уменьшение содержания свободных и появление конечных продуктов глубокого гликирования. В работе впервые исследовано влияние карнозина на функциональные свойства Г и Фактина в присутствии и в отсутствие факторов гликоокисления i vi и i viv. Впервые показано, что в отсутствие моносахаридов карнозин в концентрации мМ не влияет на функциональные свойства Фактина скелетных мышц кролика способность активировать аденозинтрифосфатазу
стандартизированного препарата миозина в присутствии и связывать гликолитический фермент альдолазу. Впервые выявлено влияние карнозина на структурные и функциональные свойства актина скелетных мышц i viv на модели крыс с повышенным уровнем моносахаридов в организме генетическая линия с экспериментальной галактоземией и усиленной выработкой свободных радикалов в тканях. Впервые показано, что гипергликемия, вызванная у человека сахарным диабетом, не влияет на структурные и функциональные свойства актина комплекса цитоскелетных белков теней эритроцитов. ЫНггрупп и конечных продуктов глубокого гликироваиия. Впервые показано ингибирующее влияние карнозина на образование конечных продуктов глубокого гликироваиия и окислительное расщепление мономера актина при гликоокислении i vi белка в Г и Фформе и продемонстрирован преимущественно антиоксидантный механизм защитного действия карнозина. Проведенное исследование вносит существенный вклад в понимание биологической значимости природного дипептида карнозина и дополняет результаты экспериментальной работы кафедры биохимии Московского государственного университета под руководством академика С. Е. Северина. Основным результатом работы является вывод о преимущественно антиоксидантном механизме защитного действия карнозина на функциональные свойства основного сократительного и цитоскелетного белка актина в условиях гликоокисления. Практическая значимость полученных данных заключается в возможности использования карнозина в качестве лекарственного препарата для защиты актинового цитоскелета клетки от повреждений, вызываемых действием активных форм кислорода при гликоокислении и старении организма. Результаты исследования показывают преимущество карнозина перед применяемым в медицинской практике аминогуанидином как менее токсичного антигликоокислителыюго препарата. Представленные в работе данные были использованы при чтении курсов лекций Молекулярные основы подвижности и Биохимическая адаптация, а также в магистерской программе Биохимия адаптации на кафедре биохимии биологопочвенного факультета СанктПетербургского государственного университета. Материалы диссертации были представлены на конференции молодых физиологов и биохимиков России Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций СанктПетербург, , на Всероссийской конференции по биохимии и биофизике мышечного сокращения Пущино, , на Втором Съезде Биохимического общества Российской Академии Наук Москва, , на XXXIII Международном Конгрессе по физиологическим наукам СанктПетербург, , на Международном симпозиуме Биоантиоксидант в рамках международной выставки Медицина и охрана здоровья. Медгехника и Аптека Тюмень, , на 1й Медикобиологической конференции молодых ученых СанктПетербурга СанктПетербург, , на Конференции молодых ученых России с международным участием Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины, посвященной 0летию ММА им. И.М.