Роль периферического бензодиазепинового рецептора в начальных стадиях апоптоза и индукции неспецифической поры митохондрий

• Автор: Грачев, Дмитрий Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 109 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Структура и функции митохондрий.

1.2. Структура и функции митохондриальных мембран.И

1.3. Каналы внутренней мембраны Мх.

1.3.1. Анионный канал внутренней мембраны

1.3.2. ПолуРТР 1а1РТР, НР

1.3.3. пйКу 1.3

1.4. Неспецифическая кальцийиндуцируемая, циклоспорин Ачувствителъная пора внутренней мембраны Мх РТР
1.5. Периферический бензодиазепиновый рецептор.
1.5.1. Лиганды ТБРО
1.5.2. Молекулярная структура ТБРО.
1.5.3. ТЭРО при стрессе и неврозах.
1.5.4. ТЭРО и апоптоз
1.5.5. Т8РО и рак
1.5.6. Гормональная регуляция плотности ТБРО в эндокринных и не эндокринных органах.
1.5.7. Т8РО и биосинтез стероидов
1.5.8. ТЭРО и фосфорилирование.
1.5.9. ТБРО и биосинтез гема.
И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Химические препараты и биологические объекты.
2.2. Выделение Мх из мозга крыс
2.3. Выделение Мх из культур клеток первичных астроцитов и глиомы С6.
2.4. Определение белка по Лоури
2.5. Фосфорилирование митохондриальных белков.
2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле
2.7. Иммуноблот и иммунопреципитация.
2.8. Измерение величины трансмембранного потенциала в Мх
2.9. Определение выхода цитохрома с и АН
III. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Идентификация ТБРО в Мх мозга и астроцитов крысы и Мх клеток глиомы С6
3.2. Определение митохондриальных параметров
3.3. Исследование участия РВШТБРО в индукцию РТР в Мх мозга крысы
3.3.1. Исследование влияния лигандов РВЯТБРО на индукцию РТР.
3.3.2. Исследование влияния ОВ1 на РТРстимулирующий эффект иальмитоилСоА.
3.3.3. Влияние антител к ТБРО на функциональное состояние Мх мозга крысы
3.4. Влияние антител к ТБРО на выход апоптогенных факторов из Мх мозга крысы.
3.5. А1МТ белокпартнер ТБРО, при открывании РТР
3.6. Вовлечение ТБРО в индукцию РТР в Мх клеток культуры глиомы С6
3.7. Са2зависимое фосфорилирование Мх мозга и астроцитов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Экспрессия при различных патологиях, повидимому, связана с нарушением его многочисленных биологических функций таких как регуляция клеточной пролиферации, дифференциации и апоптоза стероидогенез и транспорт холестерина, биосинтез гема и транспорт порфирина. Следует отметить, что лимитирующие стадии стероидогенеза и биосинтеза гема перенос холестерина и протопорф ирина на внутреннюю мембрану митохондрий Мх протекают в Мх с помощью . Установлено, что уровень в клетках повышается при опухолевой трансформации в клетках легких, кишечника, гортани, яичников простаты, нейробластомы, глиомы, гепатокарциномы, опухолевых клетках молочной железы. В клетке локализован во внешней мембране Мх, концентрируясь в контактных сайтах. Он представляет собою гримерный комплекс, состоящий из кДа белка, названного недавно белоктраислокатор , потенциалзависимого анионного канала V и переносчика адениновых нуклеотидов . При изучении широко используют его высокоафинные лиганды как искусственные РКП 5 и 5, так и эндогенные холестерин, протопорфирин и ингибитор связывания диазепама I. , vi, . Мх. Однако эксперименты, выполненные на мышах с выключенными генами V и , показали, что эти два белка не формируют структу ру поры . . . Функционирование РТР рассматривают как начальную стадию программируемой гибели клеток апоптоза. Несмотря на многолетние исследования, к настоящему моменту точный состав поры не установлен, так же как и механизм регуляции ее функционирования. Эта ситуация усугубляется тем фактом, что в последнее время получены данные, вызывающие сомнение относительно структурной роли V и в РТР и отсутствовали данные, подтверждающие непосредственное участие в функционировании РТР. В дополнение к выявлению структурного состава РТР, большое значение имеет понимание механизма регуляции функционирования РТР. В связи с этим, стоит напомнить, что , V и белки семейства Вс 12, известные как регуляторы РТР, подвержены РКАзависимому фосфорилированию. Ранее в Мх печени и мозга нами были обнаружены мембраносвязаиные фосфобелки, уровень фосфорилирования которых коррелировал с открытием РТР, что позволило нам предположить существование механизма регуляции функционирования РТР, опосредованного фосфорилированием дефосфорилированием белков Мх, осуществляемым протеинкиназами фосфатазами. В связи с вышеизложенным, представляется актуальным выяснение вопроса о присутствии в Мх, изолированных из тканей мозга, первичной культуры, астроцитов и клеток глиомы С6 в условиях открытой поры, выяснение его непосредственного участия в функционировании РТР с использованием антител, выработанных к и проведением экспериментов на Мх, изолированных из клеток глиомы С6, с пониженным содержанием нокдаун а так же исследование возможного вовлечения на начальные стадии апоптоза и влияние его лигандов на эти процессы, а также роль и его лигандов на уровень фосфорилирования белков в Мх. Цель и основные задачи исследования. Целью данного исследования было выявление непосредственного участия в функционировании РТР, а также вовлечение и его лигандов в регуляции РТР. Выявить содержание в Мх методом и определить форму мономердимер, в которой присутствует в Мх, изолированных из мозга крыс, первичной культуры астроцитов и клеток глиомы Сб. Са , индуцирующих открытие РТР и. Исследовать возможную корреляцию влияния лигандов на фосфорилирование мембранносвязанных белков Мх с индукцией открытия РТР. Научная новизна. Впервые детально исследовано влияние лигандов экзогенных и эндогенных на параметры открытия РТР скорости входа и выхода Са2 из Мх, а также диссипацию мембранного потенциала. 1. будучи лигандом , вовлекается вместе с ним в функционирование РТР в Мх. В частности, показано, что пептид обладает способностью блокировать индукцию выхода кальция и падение мембранного потенциала, демонстрируя подобный эффект.