Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты

• Автор: Ефременко, Елена Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 433 с. : ил.

Несмотря на эффективность и эксирессность, этот метод, очевидно, имеет ряд недостатков, главным из которых является его большая неточность, основанная на визуальной оценке полученных результатов возможная минимальная концентрация клеток для определения этим методом 4 клмл. В целом, методы, основанные на особенностях строения клеточной стенки, позволяют дифференцировать бактерии, принадлежащие к большим группам, но не определять их более подробную принадлежность. ПЦР с использованием прямых и обратных праймеров для определения последовательности гена рРНК. Способ предусматривает экстракцию ДНК из клеток для последующего проведения ПЦР с использованием соответствующих праймеров. Существуют различные модифицированные варианты этого метода для идентификации разных бактериальных клеток, в частности, бактерий, окисляющих ароматические полицикличсские углеводороды нефти 2, молочнокислых бактерий , СВБ 5, стрептококков Г6 и др Варианты метода, предназначенные для различных бактерий, отличаются, соответственно, объектом экстракции ДНК, применяемыми регентами для эксгракции ДНК и используемыми праймерами в ПЦР. Этот способ является высоко чувствительным и универсальным, позволяет проводить идентификацию бактерий до рода вида с использованием iпрограммы I . Существуют способы дифференцированного определения бактерий с помощью иммунологических методов, в частности применения антител, высокоспецифично взаимодействующих с бактериями определенного рода 7. Как правило, метод позволяет определять клетки, присутствующие в образце, в концентрации не менее 3клмл. Способы дифференцированного определения численности клеток с помощью иммунологических методов тоже не лишены существенных недостатков, главным из которых является их неуниверсальностъ и необходимость предварительного получения высоко специфичных моноклональных антител для каждого определяемого типа бактерий, что делает сами методы дорогими. Вместе с этим иммунологические методы определения в основном используют антитела, которые реагируют с поверхностным антигеном бактерий и, поэтому, дают информацию о присутствии тех или иных клеток, а не их метаболическом состояние и каталитической активности. Согласно предложенному подходу, дифференцировался бактериальный и немикробный свободный и соматический АТФ путем обработки образцов 0,1 М раствором перийодата натрия в 5 Тритоне Х0. В результате такой обработки свободный и находящийся в соматичеких клетках АТФ разрушался. Бактериальные клетки в данном случае . АТФ из клеток экстрагировали ДМСО, и в полученном экстракте клеток биолюминесцентным методом определялась концентрация АТФ. По калибровочным графикам устанавливалась фактическая концентрация клеток в среде. Необходимо указать, что, несмотря на высокую точност биолюминесцснтного метода, он сам не позволяет дифференцировать разные виды бактерий, присутствующие в смеси, а только определять общую численность бактерий. При этом численность бактерий, определяемая в среде для подращивания клеток, отражает количество клеток, фактически выросших в ней, и позволяет лишь весьма условно судить об исходной концентрации клеток в образце. Таким образом, существует масса способов, предназначенных для. В данной работе решалась задача разработки способа дифференцированного определения численности разных бактерий в смешанных культурах, находящихся в составе ГБК на основе иммобилизованных клеток бактерий, с использованием преимуществ биолюминесцснтного метода определения АТФ. Поставленная задача решалась за счет применения комбинированного подхода, сочетающего в себе микробиологические приемы работы с клетками микроорганизмов, основанные на использовании селективных питательных сред для культивирования клеток, биолюминесцентный метод анализа концентрации внутриклеточного АТФ, позволяющий достоверно оценить численность клеток в образцах и получать информацию о кинетике роста клеток, а также стандартные математические методы обработки данных по кинетике роста микроорганизмов, позволяющие установить начальную концентрацию клеток в образце рис Применение селективных сред, предназначенных для культивирования определенных клеток, позволяло осуществлять их дифференциацию в процессе культивирования образца смешанных культур.