Исследование структуры и механизма функционирования ретиналь-содержащих мембранных белков: кристаллизация и фиксация промежуточных состояний белков в кристаллах

• Автор: Ефремов, Руслан Геннадьевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Рстиналь содержащие белки галофильных архебакгерий

1.1.1. Функции и биологическое место.

1.1.2. Общая характеристика и свойства рстипалевых белков . i

1.2. Бактериородоисин.

1.2.1. Исторический обзор и общая характеристика

1.2.2. Фотоцикл бактериородопсина.

1.2.3. Стабилизация промежуточных состояний.

1.2.4. Кристалло1рафические структуры основного и промежуточных состояний

1.2.5. Модели транспорта протона

1.3. Сенсорный родопсин И из i i.
1.3.1. Струкгура и фотоцикл II
1.3.2. Взаимодействие с трансдыосерным белком и передача сигнала
1.4. Кристаллизация мембранных белков в липидной кубической фазе
1.4.1. Особенности кристаллизации мембранных белков.
1.4.2. Липидная кубическая фаза.
1.4.3. Методика кристаллизации в липидной кубической фазе.
1.4.4. Механизм кристаллизации в кубической фазе
1.5. Мероэдрическое двонникование белковых кристаллов.
1.6. Текущие проблемы и противоречия в исследовании и II.
1.7. Заключение.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ
2.1. Материалы для кристаллизации.
2.1.1. Моноглицериды
2.1.2. Октилглкжозид
2.2. Получение и очистка бактериородопсина
2.2.1. Культивация бактерий.
2.2.2. Выделение ПМ.
2.2.3. Солюбилизация .
2.2.4. Определение концентрации и качества .
2.2.5. Определение концентрации детергента
2.3. Кристаллизация бактериородопсина в кубической фазе
2.4. Расщепление двойниковых кристаллов
2.5. Дифракция нейтронов и определение симметрии и постоянной решетки
кубической фазы.
2.6. Установки для малоугловой дифракции и рассеяния нейтронов ЮМО и Д.
2.7. Установки для рентгеновской кристаллографии белков
2.8. Определение фактора двойникования кристаллов
2.9. Принципы измерения спектроскопических данных с разрешением по времени
2 Инфракрасная Фурьсспектроскопия. Принцип пошагового сканирования
2 Установка для спектроскопии кристаллов
. Спектроскопия в видимом диапазоне статическая и с временным разрешением
. Спектроскопия в ИК диапазоне.
2 Определение кинетики фотоцикла выбор модели и обработка данных
ГЛАВА 3. КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ БАКТЕРИОРОДОПСИНА ИССЛЕДОВАНИЕ
МЕХАНИЗМА И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ
3.1. Введение
3.2. Изучение эволюции параметров липидной фазы в процессе кристаллизации с
помощью дифракции нейтронов.
Медленная кинетика
Быстрая кинетика
3.3. Поведение кристаллизационной системы при изменении соотношения
растворлипид
3.4. Влияние моноглицерида кристаллизация в МО, МВ и МР
3.5. Влияние октил глюкози да .
3.6. Влияние концентрации белка и
3.7. Обсуждение
3.8. Двойникование и скорость роста кристаллов
3.9. Расщепление двойниковых кристаллов на одиночные
3 Структура двойниковых кристаллов и модель возникновения двойникования .
3 Основные результаты и выводы
ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА КРИСТАЛЛОВ СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ И ФИКСАЦИЯ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СОСТОЯНИЙ В
КРИСТАЛЛЕ ДЛЯ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА
4.1. Введение
4.2. Спектроскопия кристаллов
4.2.1. Характеристика основного состояния в кристалле
4.2.2. Характерне гика фотоцикла в кристалле с помощью видимой и ИКФурьс
спектроскопии с разрешением по времени
4.3. Фиксация и характеристика промежуточных низкотемпературных состояний в
кристаллах ВЯ
4.3.1. К состояние
4.3.2. Ь и М состояния
4.3.3. состояние
4.4. Обсуждение
4.5. Рентгеноструктурные данные основного и промежуточных состояний
кристаллов
4.6. Спектроскопия кристаллов II в комплексе с I I.
4.6.1. Спекгр поглощения и фотоцикл
4.6.2. Фиксация и характеристика К состояния.
4.6.3. Фиксация и характеристика М состояния.
4.7. Кристаллографические структуры К и М состояний комплекса IIII
4.8. Основные результаты
4.9. Основные выводы
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ РАБОТЫ
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Способность живых организмов эффективно преобразовывать энергию из одного вида в другой, является одним из условий, обеспечивающих сохранение и распространение жизни. Синтез наиболее распространенного переносчика энергии в живых системах афденозинтрифосфага АТФ требует наличия градиента электрохимического потенциала на мембранах клеток или органелл, синтезирующих АТФ. Градиент электрохимического потенциала создается посредством контролируемых ферментами окислительновосстановительных и фотохимических реакций 1. Простейшим и наиболее исследованным ферментом, преобразующим энергию света в электрохимический потенциал является бактериородопин . Этот трансмембранный белок археи i i, поглощая свел, переносит протоны из цитоплазмы во внеклеточное пространство. благодаря ряду свойств доступности в больших количествах, простоте очистки и стабильности в течение последних лег был одним из самых интенсивно изучаемых мембранных белков 2.
Гомологичный сенсорный родопсин II II является фоторецептором синею света, активирующим двухкомпонентный сигнальный каскад, который является одним из самых распространенных в природе. Данная сигнальная цепь регулирует работу флагеллярного мотора и позволяет археи избегать интенсивного синего и УФ освещения, вызывающего фогоокисление и разрушение организма 3.
Актуальность


Исследование свойств кристаллов и II в комплексе с трансдыосерным белком спектроскопическими методами рассмотрено в четвертой главе. Здесь обсуждается влияние кристаллического окружения и упаковки на кинетику фотоцикла и характеристики промежуточных состояний белков. Специальное внимание уделено вопросу о способности белков совершать структурные изменения в кристалле. В этой же главе рассмотрены методы получения и характеристики стабильных промежуточных состояний фотоцикла в кристалле с использованием низкотемпературной спектроскопии. Здесь также пред стелены структуры промежуточных состояний К и М фотоцикла II в комплексе с трансдыосерным белком, которые были получены с использованием результатов данной главы. В заключении диссертационной работы представлены основные выводы и библиографический список цитируемой литературы. ГЛАВА 1. Интерес к ретиналевым белкам архебактерий возник после открытия бактериородопсина в г. Впоследствии кроме в i i1 были найдены еще три трансмембранных ретиналевых белка галородопсин и сенсорные родопсины I и II I и II. Несмотря на высокую гомологию, данные белки выполняют различные функции. Таким образом, они принадлежат к генераторами трансмембранного потенциала и участвуют в энергетическом цикле бактерий. I и II являются первыми элементами цепи фототаксиса, позволяющей бактериям искать наиболее оптимальные условия освещения посредством передачи сигнала на флагеллярный мотор и регулирования движения бактерии 3. Сенсорные родопсины взаимодействуют с соответствующими трансмембранными трансдьюссрными белками I и II, соответственно, модели которых показаны на рис. Начиная с трансдыосерных белков последующая сигнальная цепь является одним из наиболее распространенных сигнальных путей в природе . На основе анализа первичной последовательности все ретиналевые белки можно разделить на два существенно различающихся класса 3 . I 4. Имеется ввиду эффективный транспорт протона, что означает перенос протона в одном или гидроксил иона в другом направлении. Рис. Молекулярные модели четырех археродопсинов. Адаптировано из 3. Фиолетовым и зеленым цветами показаны спирали трансдыосерных белков. Несмотря на некоторые сходства семиспиралыюсть, ковалентное соединение ретиналя с белком посредством протоиировапного Шиффого основания ШО и фотоизомеризацию ретиналя, данные классы белков имеют существенно различающиеся трехмерные структуры и различные механизмы функционирования1. Распространенность археродопсинов в течение длительного времени сводилась к архебактериями, эволюционно обособленным по отношению к другим биологическим царствам. Однако в гг. Более того, функциональный анализ показал, что эти белки способны осуществлять направленный транспорт протонов . Таким образом, широкая распространенность данного класса белков, определяет актуальность их изучения, и исследование механизмов функционирования археородонсинов представляется важным для понимания фотоиндуцируемых процессов и их эволюции в живых организмах. Общая характеристика и свойства рстиналевмх белков Н. Ретиналевые белки НдаИгагит состоят из семи пронизывающих бислой аспиралей, соединенных относительно короткими петлями. В соответствии с принятой терминологией спирали именуются латинскими буквами от А до б в направлении от Мс Сконцу. Белки обладают высокой гомологией рис. Наиболее консервативные аминокислотные остатки принадлежат к ретинальсвизывающему карману. Данные остатки на идентичны и на гомологичны, при общей идентичности белков . Ретинапь погружен в центр белка ег о полиеновая цепь наклонена иод углом к плоскости бислоя и расположен на уровне, соответствующем приблизительному центру гидрофобной области мембраны. Рстиналь ковалентно соединен с консервативным Лиз спирали О 6 для ВЯ, рис. ШО рис. Положительный заряд компенсируется комплексным противоионом, основными компонентами которого являются консервативные депротоинрованные Асп2 и Асп который лишь в случае 1Ш заменен на СГ. Родописны принадлежат к классу Сспязлнных рецепторов, таким образом сигнальные каскады родопсинов и сенсорных родопсинов различаются.