Собственная флуоресценция белков : Структура и динамика макромолекул

• Автор: Туроверов, Константин Константинович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 209 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. АНАЛИЗ СВОЙСТВ МИКРООКРУЖЕНИЯ И ОСОБЕННОСТЕЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ ТРИПТОФАНОВЫХ ОСТАТКОВ БЕЛКОВ С УСТАНОВЛЕННОЙ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРОЙ

НОВЫЙ ПОДХОД В РАЗВИТИИ ТЕОРИИ СОБСТВЕННОЙ

ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ БЕЛКОВ.

1.1. Алгоритм анализа пространственной структуры белков, позволяющий выявлять факторы, существенные для понимания флуоресцентных свойств их триптофановых остатков.

1.1.1. Микроокружение триптофановых остатков

1.1.2. Плотность упаковки атомов микроокружения триптофановых остатков.

1.1.3. Доступность индольных колец триптофановых остатков молекулам растворителя.

1.1.4. Конформация боковой цепи триптофанового остатка

1.1.5. Ьезызлучательный перенос энергии возбуждения от тирозиновых остатков к триптофановым и между тринтофановыми остатками.
1.1.6. Способы наглядного представления локализации триптофановых остатков в макромолекуле белка.
1.2. Факторы, определяющие квантовый выход флуоресценции отдельных триптофановых остатков
1.2.1. Тушащие группы в составе макромолекулы белка
1.2.2. Определение вклада в излучение отдельных триптофановых остатков.
1.2.3. Влияние атомов серы на флуоресценцию триптофановых остатков лизоцима
1.2.4. Вклад отдельных триптофановых остатков во флуоресценцию актина
1.2.5. Тушение флуоресценции единственного триптофанового остатка азурина медным центром
1.3. Факторы, определяющие положение спектра отдельного триптофанового остатка.
1.3.1. Уникальные свойства микроокружения Тгр азурина.
1.3.2. Образование комплексов между индольными кольцами триптофановых остатков в возбужденном состоянии и группами микроокружения
1.3.3. Причины возникновения у ряда белков уникально коротковолновых спекгров флуоресценции
ГЛАВА 2. ДИНАМИКА СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ. ИЗУЧЕНИЕ МЕТОДОМ ВРАЩАТЕЛЬНОЙ ДЕПОЛЯРИЗАЦИИ СОБСТВЕННОЙ
ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ
2.1. Использование собственной флуоресценции для изучения внутримолекулярной подвижности в белках методом вращательной
деполяризации
2.1.1. Вращательная деполяризация флуоресценции.
2.1.2. Определение характеристик внутримолекулярной подвижности методом вращательной деполяризации при стационарном возбуждении
2.1.3. Высокочастотная внутримолекулярная подвижность
2.2. Характер внутримолекулярной подвижности триптофановых остатков, проявляющейся в деполяризации флуоресценции белков
2.3. Спектральнополяризационные характеристики флуоресценции белков и модельных соединений.
2.3.1. Проявление дуальной флуоресценции в спектральнополяризационных характеристиках излучения.
2.3.2. Участвует ли осциллятор ЪЬ в формировании спектра флуоресценции белков
2.3.3. Причины возникновения зависимости г Лрег по спектру излучения .
2.4. Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков в
белках.
2.4.1. Предельная анизотропия флуоресценции триптофановых остатков в белках.
2.4.2. Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков с различной локализацией в макромолекуле белка
2.4.3. Внутримолекулярная подвижность триптофанового остатка азурина
ГЛАВА 3. СТРУКТУРА И ДИНАМИКА БЕЛКОВ В ЧАСТИЧНОСВЕРНУТЫХ ДЕНАТУРИРОВАННЫХ СОСТОЯНИЯХ ИНАКТИВИРОВАННЫЙ АКТИН.
3.1. Инактивированный актин термодинамически стабильное промежуточное состояние белка
3.2. Вторичная сру тура инактивированного актина
3.3. Диэлектрические и релаксационные свойства микроокружения тринтофановых остатков инактивированного актина.
3.4. Локализация триптофановых остатков в инактивированном актине .
3.5. Гидродинамические размеры инакгивированного актина
3.6. Внутримолекулярная подвижность триптофановых осгатков нативного и инактивированного актина.
3.7. Свойства поверхности инактивированного актина.
3.8. Представляет ли инактивированный актин структуру тина расплавленной глобулы.
ПРИЛОЖЕНИЕ. АППАРАТНЫЕ И ПРОГРАММНЫЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ СПЕКТРАЛЬНЫХ, ПОЛЯРИЗАЦИОННЫХ И КИНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ В РАСТВОРЕ. МЕТОДИЧЕСКИЕ РАЗРАБОТКИ.
4.1. Спектральнополяризационные характеристики собственной
флуоресценции белков при стационарном возбуждении
4.1.1. Спектрофлуориметрическая установка со стационарным возбуждением
4.1.2. Интенсивность флуоресценции. Зависимость от концентрации флуоресцирующего вещества и оп тической плотности раствора
4.1.3. Определение константы равновесия в области конформационного перехода
4.1.4. Температурное тушение флуоресценции.
4.1.5. Спектры флуоресценции и спектральный параметр А.
4.1.6. Спектральный параметр А для многокомпонентной системы.
4.1.7. Использование параметра А для аналитических целей
Экспрессметод определения содержания нативного актина в его
препаратах
Характеристика белковых фракций сыворотки крови человека
Использование параметра Л для выявления на хроматограммах скрытых компонентов, не проявляющихся при измерении оптической плотности
4.2. Анизотропии флуоресценции при стационарном возбуждении
4.2.1. Основные определения.
Альтернативный способ измерения анизотропии флуоресценции .
4.2.2. Анизотропия флуоресценции для многокомпонентной системы
4.3. Кинетические характеристики флуоресценции
4.3.1. Время жизни возбужденного состояния
4.3.2. Импульсная спектрофлуориметрическая установка
Блоксхема импульсной спектрофлуориметрической установки
Импульсный источник возбуждающего света наносекундной дли
тельности
Регистрирующая система установки.
4.3.3. Обработка кинетических кривых флуоресценции.
Восстановление функции по измеренным значениям функций

Определение кинетических параметров а,, .
4.3.4. Определение характеристик внутримолекулярной подвижности из анализа временных зависимостей анизотропии флуоресценции
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В частности было показано, что наряду с состоянием типа расплавленной глобулы возможны и другие денату рированные, частичносвернутые состояния белка, например, состояние предшественник расплавленной глобулы v, v i, УвсрскиЙ, , высоко структурированная расплавленная глобула , . Во многих случаях оказалось, что переход в промежуточное состояние сопровождается агрегацией или специфической ассоциацией i, а, Ь Уверский и Финк, а, Ь макромолекул белка. Было также показано, что в денатурированных частичносвернутых состояниях подвижность боковых цепей аминокислот может значительно отличаться от их подвижности в состоянии статистического клубка v . Родионова и др. Тигоуегоу а а1. Таким образом, возникла необходимость изучения структуры и динамики денатурированных частичносвернутых состояний белков. В настоящей работе эти вопросы были детально проанализированы на примере инактивированного актина. Цель работы состояла в разработке теории собственной флуоресценции белков и использовании метода, основанного на явлении собственной флуоресценции, для изучения структуры и динамики белков в нативном и денатурированных частичносвернутых состояниях. Диссертация состоит из Введения, трех Глав. Приложения, раздела Основные результаты и выводы и Списка цитируемой литературы. Глава I посвящена описанию нового подхода для развития теории собственной флуоресценции, состоящего в анализе свойств микроокружения и особенностей локализации триптофановых остатков белков с установленной пространственной структурой и результатам его применения для достаточно большой выборки белков. Дано описание метода анализа структуры белков, позволяющего выявлять факторы, потенциально существенные для ею флуоресцентных характеристик, и способов наглядного представления локализации триптофановых остатков в макромолекуле белка анализируются факторы, определяющие величину квантового выхода и положения спектра флуоресценции отдельного триптофаиового остатка. Подробно проанализирован вклад отдельных триптофановых остатков в излучение в актине и лизоциме, ту шащее действие медного цен тра на флуоресценцию единственного триптофаиового остатка азурина. Отмечается, что ту шащее действие атомов серы остатков цистеина и метионина существенно зависит от их пространственной локализации относительно индольного кольца. Глава II посвящена изучению динамики структуры белков с помощью метода вращательной деполяризации собственной флуоресценции. Приводятся результаты анализа зависимости анизотропии флуоресценции по спектру излучения для ряда белков и модельных соединений, позволившего сделать очень существенное как для теории собственной флуоресценции, гак и для использования метода вращательной деполяризации, заключение о том, что осциллятор Ьь не участвует в излучении. Б этой же главе приводятся результаты изучения внутримолекулярной подвижности ряда белков, полученные с помощью метода вращательной деполяризации. Показано, что триптофановые остатки большинства исследованных белков участвуют в высокочастотной внутримолекулярной подвижности, а некоторые, кроме того, во внутримолекулярной подвижности со временем релаксации, сопоставимым со временем жизни возбужденного состояния. Из сопоставления величин Iго и спектрального параметра А згозвз сделан вывод о том, что высокочастотной внутримолекулярной подвижностью обладают не только триптофановые остатки, локализованные на поверхности макромолекулы, но также и триптофановые остатки, локализованные во внутренних гидрофобных областях макромолекулы белка. Глава III посвящена изучению структуры и динамики белков в частичносвернутых денатурированных состояниях. Приводятся результаты изучения денатурации актина под воздействием ОйтО, мочевины и нагревания, выполненного путем регистрации параметра А, анизотропии триптофановой флуоресценции и интенсивности флуоресценции гидрофобного зонда АПС. Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков актина в различных структурных состояниях проанализирована с помощью метода вращательной деполяризации флуоресценции.