Анализ продуктов протеолиза бычьего фибриногена и коллагена типа I при помощи времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрии

• Автор: Сунгуров, Юрий Владимирович
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 156 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Матричноактивированная лазерная десорбционно ионизационная МАЛДИ массснектрометрия биомакромолекул

1.1.1. Общие принципы массспектрометрии. Способы десорбцииионизации

1.1.2. Принцип метода МАЛДИ

1.1.3. Массанализаторы в МАЛДИ массспсктромстрии. Времянролетный ВПанапизатор

1.1.4. Матрицы для МАЛДИ массспекчрометрии

1.1.5. Качество МАЛДИ массспектра и его характеристики

1.2. Пробоподготовка белковопептидных смесей для МАЛДИ МС анализа

1.2.1. Общие моменты в пробоподготовкс аналитов для МАЛДИ МС анализа
1.2.2. Матрицы для МАЛДИ МС анализа белковопеп гидных смесей
1.2.3. Подготовка белковопептидных образцов для получения качественных МАЛДИ массспектров
1.3. Использование МАЛДИ массспектрометрии для анализа белков и пептидов
1.3.1. Идентификация белков с помощью картирования пептидных масс
1.3.2. Обоснование лостгрансляционных модификаций белка с известной аминокисло гной последовательностью
1.3.3. Применение МАЛДИ МС в диагностике
1.3.4. Вычислительные инструменты для МЛЛДИ МС анализа белков
1.3.5. Проблемы МЛЛДИ МС анализа продуктов реакций протеолиза
I.4. Структура бычьего фибриногена и коллагена типа I.
Биохимические подходы к исследованию их протеолиза
1.4.1. Бычий фибриноген
1.4.2. Коллаген типа I
ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
И. 1.Материалы
II.2. Ферментативный гидролиз коллагена типа I и бычьего фибриногена
II.2.1. Гидролиз коллагена типа I
Н.2.2. Гидролиз бычьего фибриногена
.3. Электрофорез в ПААТ в денатурирующих условиях
.4. Трипсинолиз белков из геля
.5. Подготовка образцов для массспектрометрического анализа
.6. Получение МАЛДИ массспектров
.7. Очистка полученных массспектров
.8. Обработка очищенных массспектров
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1.1. Изучение механизма протеолиза бычьего фибриногена
МАЛДИ массспектромстрическим картированием триптических пептидов высокомолекулярных продуктов реакции
III. 1.1. Выбор модельного белка
1.1.2. Условия получения гидролизатов бычьего фибриногена
Ш.1.3. Подбор условий для получения качественных массспектров
триптических пептидов фрагментов бычьего фибриногена
1.1.4. Исследование механизма протеолиза бычьего фибриногена
изоформой СКП2 с помощью МЛЛДИ массспектромегрии Ш.2. Скрининг коллагеназ при помощи МАЛДИ масс
спектрометрических фингерпринтов продуктов протеолиза коллагена типа I
Ш.2.1. Условия получения гидролизатов коллагена типа I
Ш.2.2. Подбор условий для получения качественных массспектров
гидролизатов коллагена типа I
III. 2.3. Сравнительный анализ массспектров гидролизатов,
полученных в результате обработки коллагена типа 1 ферментами разных классов
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Наличие в образце низкомолекулярных добавок соли, компоненты буферных растворов, детергенты и т. Тем не менее, при правильном и тщательном подборе условий пробоподготовки удается получить масссиекгры даже таких сложных систем, как биологические жидкости. Таким образом, отработка условий пробоподготовки образцов для получения воспроизводимых и качественных МАЛДИ массспектров и увеличения выходов сигналов выбор оптимальной матрицы, способа нанесения образца па мишень. МЛЛДИ массспектрометрии. Целью настоящей работы явилось изучение новых возможностей метода МЛЛДИ для определения механизма реакций протеолиза высокомолекулярных белковых субстратов на примере бычьего фибриногена, а также первичного скрининга коллагеназ выяснение специфичности действия коллагенолитических ферментов разных классов на коллаген. Выбор модельного белка для изучения механизма его протеолиза методом МАЛДИкартирования высокомолекулярных продуктов реакции. Изучение возможности применения МАЛДИкартирования высокомолекулярных продуктов протеолиза для установления механизма расщепления бычьего фибриногена изоформой сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба. Отработка процедуры пробоподготовки реакционных смесей в ходе протеолиза белковых субстратов с целью получения воспроизводимых и качественных спектров МАЛДИ и увеличения выхода сигналов. Проведение сравнительного анализа спектров МАЛДИ гидролизатов коллагена, полученных под действием коллагеназ разных классов. Изучение возможности первичного скрининга коллагеназ по МАЛДИ фингерпринтам продуктов гидролиза коллагена. ГЛАВА I. Матричноактивированная лазерная десорбционноионизационная МАЛДИ массснектрометрия биомакромолекул. Общие принципы массспектрометрни. Способы десорбцииионизации. Принципом массспсктрометрии является измерение отношения массы к заряду газообразных ноной. Поскольку измерение величины ионов происходит в газовой фазе, анализируемое вещество должно быть переведено в газообразное состояние и ионизировано. Небольшие летучие термостабильные молекулы могут быть достаточно легко переведены в газовую фазу в результате температурной возгонки и ионизированы даже такими ранними технологиями, как электронный удар 1 и химическая ионизация 2. Однако более лабильные органические молекулы в том числе и биомолекулы не могут быть ионизированы данными методами без чрезмерной и неспецифической фрагментации. Первые попытки десорбировать органические молекулы были предприняты в конце х, когда Бекксй предложил нолевую десорбцию , метод, который открыл небольшой путь в область массспскзромстрии биоорганических молекул 3. За ней последовала массспектрометрия вторичных ионов I, в частности статическая I, представленная Бсннинювсном в 4. В году, благодаря Барберу, этот метод получил развитие внедрением 1 органических соединений, растворенных в глицерине, которое Барбер назвал бомбардировка быстрыми атомами 5. Принцип десорбции бомбардировкой органических образцов продуктами распада деления ядра СГ, позднее названной плазменная десорбция , был опубликован Р. Макфарлэйном в году 6. Суть методов кратко изложена в таблице 1. Таблица 1. Характеристика методов десорбцииионизации. Несколько групп продолжили проведение этой линии исследовании, по большей части 1руппа П. Кисгсмекера в Амстердамском университете. Многие годы амстердамская группа удерживала рекорд определенной массы биооргаиического аналита, десорбированного Слазером с длиной волны ,6 мкм в дальнем инфракрасным диапазоне исдериватизировапиый дигитонин, Да
Независимо и параллельно этой группе, Хиллепкамп и Кауфманн развили лазерный микропробный массанализатор ЬАММА . Ограничивающие чувствительность ЬАММА спектров шумы были сигналами, которые были вскоре идентифицированы как происходящие из органического полимера, используемого в анализе. Эти шумы инициировали поиск возможностей анализа органических образцов, что, в конечном счете, привело к открытию принципа МАЛДИ. Принцип и его акроним были опубликованы в году , а первый пик молекулярного иона нелетучего меллитина из пчелиного яда, олигопептида с массой Да в году .