Изучение роли остатков цистеина в функционировании люциферазы светляков Luciola mingrelica методом сайт-направленного мутагенеза

• Автор: Модестова, Юлия Александровна
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

О необычайной эффективности каталитического аппарата люциферазы косвенно свидетельствует также тот факт, что, согласно данным , свечение увеличивает скорость метаболизма жукасветляка всего на по сравнению с состоянием покоя, в то время как при ползании данная величина возрастает на . Схема люциферазной реакции, механизм которой подробно изложен в работе , приведена на рис. На первой стадии реакции фермент связывается с субстратами люциферином и АТР. После образования тройного комплекса люциферин ковалентно взаимодействует с АТР, образуя смешанный ангидрид карбоксильной и фосфорной кислот люцифериладенилат. Иирофосфат при этом отщепляется. Люцифериладенилат через ряд промежуточных реакций окисляется кислородом воздуха с образованием циклического пероксида диокситанона, из которого в свою очередь образуется продукт люциферазной реакции оксилюциферин в синглетном электронновозбужденном состоянии. В зависимости от микроокружения электронновозбужденный оксилюциферин может существовать в трех формах в виде кетона, енола и снолятиона. В работе было показано, что спектр биолюминесценции люциферазы светляков i ii является суперпозицией спектров биолюминесценции трех форм электронновозбужденного оксилюцифсрина кетона Xах 8 нм, енола ктйХ 7 нм и енолятиона Х,пах 6 нм. Зависимость положения максимума биолюминесценции от объясняется сдвигом равновесия между возможными формами оксилюциферина. У
О
о
Рис. Биолюминссцентная реакция окисления люциферина светляков II. Люцифераза светляков принадлежит к суперсемейству аденилатобразующих ферментов, катализирующих аденилирование карбоксильной группы субстрата при использовании А ГР в качестве АМРдонора ,. Она имеет заметное сходство первичной структуры с АТРзависимыми ацилСоАлигазами и нсрибосомальными пептидсинтетазами . Результаты, полученные и проанализированные в работах , указывают на то, что люцифераза также обладает активностью ацилСоАсинтетазы длинноцепочечных жирных кислот, которая, в свою очередь, является предполагаемым эволюционным предком люциферазы. Люцифераза состоит из двух доменов, большого Мдомсна остатки и малого Сдомена остатки, соединенных подвижной петлй остатки. В свою очередь, в домене можно выделить два явно выраженных субдомсна , А и В , образующих между собой прочный гидрофобный контакт рис. В процессе связывания с субстратами происходит поворот Сдомена примерно на относительно чдомена, что приводит к переходу от открытой к закрытой конформации люциферазы, при которой оба домена находятся в тесном контакте. Активный центр люциферазы образуется на границе взаимодействия 1 и Сдоменов люциферазы. Основная часть активного центра, в том числе области связывания субстратов находятся во втором субдомсне Идомена, но для эффективного протекания реакции необходим и ряд остатков Сдомсна ,. Субдомен А
Рис. Структура люциферазы светляков Ь. ЫЧдегидролюциферилсул1фамоиладенозином ДЛСА . Первая кристаллическая структура люциферазы РИопим ругаШ была получена в году , для свободного фермента. Несколько позднее была получена практически совпавшая с ней структура люциферазы Р. Бранчини были получены модели люциферазы в комплексе с субстратами и построены модели активного центра фермента. Позднее, в году, году были получены кристаллические структуры люциферазы сгисаа в комплексе с КАТР, аналогом промежуточного продукта реакции аденилирования ОБА и в комплексе с продуктами реакции оксилюцифсрином и АМР. Таким образом была установлена следующая структура активного центра люциферазы рис. Рис. Активный центр люциферазы светляков Р. Таким образом, было установлено, что в состав активного центра входят следующие аминокислотные остатки Нз7, ОуЗ , ЬувбЗ, ТЬг9, 1е8, Аг0, Т1г3, 5ег9, РИе9, ТЪг5, 8ег0, БегО,у1, А1а0, а также остаток Ар4, не приведенный на рис. В течение последних лет люциферазы активно изучались. К настоящему моменту клонированы и ссквенированы различных люцифераз жуков . Наиболее изученными являются люциферазы светляков РИопия ругах, исоа сгисаа и мсоа тпгеса. Все люциферазы светляков состоят из одной белковой цепи остатков, не содержат кофакторов и простетических групп, имеют сходный аминокислотный состав.