Изучение субстратной специфичности пенициллинацилазы методами молекулярного моделирования

• Автор: Строганов, Олег Валентинович
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 153 с. : ил.

Содержание.

Список сокращений

Введение

1 Литературный обзор

1.1 Строение и механизм пенициллинацилазы

1.1.1 Общие сведения о ферменте

1.1.2 Кинетические исследования механизма катализа.

1. Структура активного центра пенициллинацилазы.

1.1.4 Строение и механизм действия пенициллинацилазы поданным РСА.

1.1.5 Строение участка связывания ацильной части

1.1.6 Участок связывания нуклеофила.

1.1.7 Исследование пенициллинацилазы методами теоретической химии.
1.2 Метод молекулярной динамики.
1.2.1 Общее описание метода .
1.2.2 Силовое поле ОРЬ5АА
1. Методы интегрирования уравнений движения
.4 Расчеты при постоянной температуре
1.2.5 Использование периодических граничных условий.
1.2.6 Ускорение МДрасчетов.
1.3 Методы молекулярного докинга
1.3.1 Алгоритмы сканирования потенциальной поверхности
1.4 Методы расчета свободной энергии связывания.
1.4.1 Введение
1, Метод возмущений свободной энергии
1.4.3 Методы линейной корреляции свободной энергии
1.4.4 Приближения аддшгивных вкладов в свободную энергию связывания.
1.4.5 Использование эмпирических скоринговых функций для расчета ДО.
1.5 Методы расчета каталитических констант
1.5.1 Введение
1.5.2 Гибридные квантовомеханическиемолекулярномехаиичсские методы
расчета поверхности потенциальной энергии.
1.5.3 Метод эмпирической валентной связи .
1.5.4 Приближенные оценки соотношений каталитических констант.
2 Экспериментальная часть.
2.1 Пакеты программ, использованные в работе.
2.2 Конструирование моделей систем для расчета траекторий.
2.2.1 араметризация силового поля лигандов.
2. Конструирование моделей ферментов.
2.2.3 Конструирование фсрментсубстратных комплексов
2.2.4 Релаксация системы
2.2.5 Параметры молекулярнодинамических расчетов.
2.2.6 Анализ траекторий.
2.2.7 Расчет свободной энергии связывания лиганда с фермером
2.2.8 Расчет предреакционной статистики для продуктивных фермент
субстратных комплексов
3 Результаты и обсуждение.
3.1 Общая характеристика структуры ПЛ в растворе.
3.2 Конформациошгая лабильность ПА.
3.2.1 Конформационные переходы в активном центре ПА
3.2.2 Оценка энергии перехода из открытого в закрытое состояние
3.3 Механизм действия пенициллинацилазы
3.3.1 Структурные критерии предреакционного состояния
3.3.2 Оценка влияния диффузии на связывание субстратов.
3.4 Г ид рол из рлактамных антибиотиков .
3.4.1 Параметризация пенициллина для силового поля ОРЬБАА.
3.4.2 Продуктивный комплекс бензнлпенициллина с ПА.
3.4.3 Связывание субстратов за пределами активного центра
3.4.4 Механизм проникновения субстратов в активный центр
3.4.5 Расчет кинетических параметров ферментативной реакции.
3.5 Синтез Рлактамных антибиотиков.
3.5.1 Параметризация рлактамных нуклеофилов .
3.5.2 Продуктивные комплексы Рлактамных нуклеофилов качественные
результаты
3.5.3 Структура эпилированного фермента.
3.5.4 Количественная оценка параметра нуклеофильности Р.
3.5.5 Непродуктивное связывание нуклеофилов .
3.6 Гйдролиз фенилацетильных производных аминокислот.
3.6.1 Общая характеристика исследуемых систем.
3.6.2 Продуктивное связывание энантиомерных субстратов
3.6.3 Расчет констант Михаэлиса для Ыфенилацетильных производных
аминокислот
3.6.4 Непродуктивное связывание Ыфенилацетильных производных ароматических аминокислот
3.6.5 Расчет каталитических констант
4 Основные результаты и выводы.
5 Список литературы.
Список сокращений
НА пенициллинацилаза
БП бензилпенициллин
БПМе метиловый эфир бензилпенициллина
6ЛПК 6аминопенициллановая кислота
7АДЦК 7аминодезацетоксицефалоспорановая кисле
РАА фенилуксусная кислота
РвЛ фенилацетамид
РАБ фенилацетилсерин
РвБ фенилглицилсерин
ЫРЬас Мфснилацетил
фенилглицин
РЕА фенилэтиламин
РБО сульфоксид бензилпенициллина
РМББ фенилметилсульфонилфторид
РСА рентгеноструктурный анализ
мд молекулярная динамика
мм молекулярная механика
дм квантовая механика
Е метод возмущений свободной энергии
А метод приближения линейного отклика
НЕ метод линейной энергии взаимодействия
БАБ сольватнодоступная площадь поверхности
ЯМБИ среднеквадратичное отклонение
ЯМББ среднеквадратичная флуктуация
БСР экранированный кулоновский потенциал
Л предреакционные конформации
Е стереоспецифичность ЕЛеиХм1шм
Введение
Актуальность


Ингибиторный анализ позволил определить локализацию тех или иных взаимодействий на участке р не вдаваясь в детализацию аминокислотного состава активного центра. Исходя из субстратной специфичности, был сделан вывод о гидрофобной природе взаимодействий с активным центром. На основе данных ингибиторного анализа была предложена экстрационноконформационная модель сорбции в активном центре фермента8. Суть модели заключается в следующем гидрофобная полость в свободном состоянии имеет термодинамически невыгодный контакт с окружающей средой, и в результате гидрофобного взаимодействия ингибитора или субстрата с ферментом имеет место двойной выигрыш в энергии, складывающийся из энергии переноса гидрофобного субстрата из воды в гидрофобную полость фермента и выигрыша энергии за счет вытеснения воды из активного центра. Однако для объяснения специфичности пенициллинацилазы к ацильной части недостаточно учета только гидрофобных взаимодействий. Из данных ингибиторного анализа можно сделать вывод о жесткой стерической ограниченности участка связывания ацильной группы в активном центре фермента. Проводя анализ констант ингибирования для аналогов фенилуксусной кислоты, часть из которых представлена в таблице 1, нетрудно заметить явную связь ингибирующей способности лиганда с числом заместителей в бензольном ядре. Литсрагрный обзор. Таблица I. Константы ингибирования пенициллинацилазы из Е. Тиофенуксусная кислота 0. Фенол 0. ОНРАА 0. ШхРАА 0. ЫОгРАА 2. ОНРАА 3. ОНРАА 5. Также ингибирующая способность зависит от природы и местоположения заместителя. Так, для озамещенных РАА наблюдается двухпараметровая корреляция энергии связывания ингибитора с его гидрофобностью и молекулярным объемом, причем, ингибирование ухудшается с ростом гидрофобности заместителя и его молекулярного объема. Для м и пзамещенных РАА, напротив, гидрофобность заместителя вносит положительный вклад в энергию связывания лиганда с ферментом, а величина молекулярного объема заместителя практически не влияет на эту величину. Введение заместителя в аположение РАА приводит к резкому ухудшению параметров связывания. Кроме того, важную роль играют длина гидрофобного радикала наиболее подходящим является бензил и уплощенность его структуры ациклические производные плохие ингибиторы. Показано, что характер взаимодействия бокового радикала аминокислоты на участке р2 также носит гидрофобный характер, однако он выражен не столь ярко, как в случае взаимодействия на р. Изучение участка связывания карбоксильной группы рз было проведено на примере ряда фенилацетильиых Эаминокислот. Было отмечено, что этот участок отвечает за энантиоселективность фермента, причем фенилацетильные производные Оаминокислот с положительно заряженным боковым радикалом являются наихудшими субстратами. Ремтгеноструктурный анализ открыл новые возможности для гораздо более детального изучения строения фермента, а также для создания на основе его структуры моделей взаимодействия фермента с субстратами и ингибиторами. ПА из Е. И с разрешением в 1,9 А рбЬ ГО 1рпк. Позже, при определении структуры из моноклинной формы кристаллов в присутствии этиленгликоля, разрешение удалось повысить до 1,3 А рбЬ ГО к9. Однако обе структуры оказались практически идентичными с той только разницей, что в последней присутствуют остатков Сконца ацепи, которые не определялись ранее. Согласно полученным данным, обе цепи, из которых состоит ПА, тесно переплетены и формируют пирамидальную структуру с глубокой чашеобразной выемкой в центре, на дне которой находится активный центр рисунок 5. Рисунок 5. Как уже отмечалось выше, до появления данных РСА выдвигались предположения о том, в ходе реакций, катализируемых ПА, происходит ацилирование остатка серина. На это указывти дашше по инактивации фермента , который специфически ковалентно модифицирует остатки серина, а также возможность реактивации фермента в присутствии внешнего нуклеофила. Данные РСА по ковалентному комплексу ПА с I I полностью подтвердили все высказанные ранее предположения, и уточнили, что этим ключевым остатком является концевой серии цепи.