Рекомбинантная пероксидаза табака: получение и каталитические свойства

• Автор: Хушпульян, Дмитрий Михайлович
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

Ферменты катализируют окисление различных элсктронодонорных субстратов пероксидом водорода. Каталитический цикл начинается с быстрого взаимодействия фермента и пероксида водорода с образованием т. Соединения I. Соединение I содержит 2 окислительных эквивалента оксиферрилгсм и свободный радикал. Соединения II, а затем нативного фермента, как показано на Схеме 1. Оксигеназный цикл, как предполагается, действует при окислении гормона роста растений, индолилуксусной кислоты. Суперсемейство пероксидаз растений подразделяется на 3 класса на основе гомологии аминокислотных последовательностей и особенностей посттрансляционной модификации 9. Класс I включает микробиальные прокариотические пероксидазы бактериальные каталазыпероксидазы КФ . С пероксидазу КФ . КФ Класс II это пероксидазы грибов, включающие лигнинпероксидазу, марганецпероксидазу и секреторные пероксидазы растительного типа. Класс III это т. Пероксидазы двух последних классов КФ . Феррофермент

в, Н. Оксидазный

. Схема 1. Пять различных состояний активного центра пероксидаз растений. Основное состояние представлено ферриферментом, который при одноэлектронном восстановлении образует ферроформу последняя присоединяет молекулу кислорода и образует т. Соединение III. Каталитический цикл пероксидазной реакции включает Соединение I, которое образуется при двухэлектронном окислении железа активного центра и представляет собой феррилформу и катионрадикал на порфириновом кольце, и Соединение II продукт одноэлектронного восстановления Соединения I. Под действием избытка пероксида Соединение II образует Соединение III, однако при таком способе образования оно быстро разлагается под действием избытка пероксида не показано. Главную роль в гетеролитическом расщеплении пероксида играют дистальные остатки гистидина и аргинина. Пероксидаза содержит три гистидиновых остатка , и 0. Последний является проксимальным лигандом железа рис. Проксимальный i отвечает за прочное связывание гема в активном центре. При его замене на аланин константа скорости образования Соединения I падает на 5 порядков. Добавление имидазола позволяет увеличить константу в раз, восстанавливая лишь процент ферментативной активности . Полагают, что проксимальный лиганд гема i образует водородную связь с 7, которая увеличивает его основность, облегчает стабилизацию заряда в окисленных формах пероксидазы и позволяет поддерживать атом железа с координационным числом 5 . Дистальный или, как его еще называют, каталитический гистидин отвечает за расщепление пероксида водорода. Механизм образования Соединения I включает переходное образование комплекса трехвалентного железа и пероксианиона при протонировании дистального гистидина см. Схему 2. Соединение I. При замене дистального гистидина на , , V константы скорости первой стадии реакции падают на много порядков , так, замена на лейцин уменьшает константу второго порядка в реакции с пероксидом водорода на 5 порядков по сравнению с нативной и рекомбинантной формами , а константа первого порядка гетеролитического расщепления связи при образовании Соединения I падает на 4 порядка В случае мутанта i добавление 2замещенных имидазолов частично восстанавливало каталитическую активность благодаря образованию альтернативного центра связывания протонов. Создание двойного мутанта ii восстанавливает каталитическую активность фермента Мутант i имитация хлоропероксидазы на 4 порядка менее активен при взаимодействии с пероксидом водорода. Важной структурной особенностью является водородная связь i и далее к и до дистального Са2 связывающего центра, как показано на рис 1. Предполагается, что для максимальной эффективности пероксидазного катализа требуется совершенно определенная ориентация имидазольного кольца i по отношению к порфириновому кольцу, которая и реализуется посредством водородной связи между i и , . При замене на валин , разрушается водородная связь с гистидином и фермент демонстрирует очень низкую каталитическую активность. Дистальный остаток играет важную роль на всех ступенях катализа .