Использование метода фотодинамического воздействия на клетки в биолюминесцентном определении микроорганизмов и фотостерилизации

• Автор: Пометун, Евгений Владимирович
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 138 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ АТФ В ИССЛЕДУЕМЫХ КЛЕТКАХ

1.1.1. ОБЛУЧЕНИЕ ОБРАЗЦОВ, НЕ СОДЕРЖАВШИХ

СЕНСИБИЛИЗАТОРА

1.1.2. ДЛИТЕЛЬНОСТЬ ТЕМНОВОЙ ИНКУБАЦИИ КЛЕТОК С

ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОМ.

1Л .3. ПРИРОДА БУФЕРНОГО РАСТВОРА И СРЕДЫ.

1Л .4. КОНЦЕНТРАЦИЯ СЕНСИБИЛИЗАТОРА

1Л .5. ДОЗА ОБЛУЧЕНИЯ И ПУТИ ЕЕ ДОСТИЖЕНИЯ.

1.2. ВЛИЯНИЕ ФАЗЫ РОСТА НА ФОТОДИНАМИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ.

1.3. ФОТОДЕСТРУКЦИЯ КАК МЕТОД ЭКСТРАКЦИИ АТФ В БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ АТФМЕТРИИ

1.4. ВЛИЯНИЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАНЫ КЛЕТОК Е. Р I VIV.
2. ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ И ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ НА ПРИМЕРЕ Е. Н7 И . 3.
2.1. БАКТЕРИЦИДНЫЙ ЭФФЕКТ , ТВО И НА Е. I . Н7 И . 3 И МИНИМАЛЬНЫЕ ИНГИБИРУЮЩИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ.
2.2. ВЛИЯНИЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА СОДЕРЖАНИЕ ВНУТРИ И ВНЕКЛЕТОЧНОГО АТФ В Е. СОИ 7 И . 3.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


По этой причине большинство встречающихся в литературе работ, связанных с изучением фотодинамического действия, были посвящены фоторазрушению клеток млекопитающих. Однако в последние годы возрос интерес исследователей к фотодинамическому повреждению бактериальных клеток фотодинамической антимикробной химиотерапии ФАХТ 4. В основном это связано с необходимостью поиска новых путей стерилизации зараженных объектов и лечения микробных инфекций изза быстрых эволюционных изменений в природе, приводящих к появлению широкого разнообразия антибиотикоустойчивых патогенных штаммов. Это также требует поиска новых более дешевых антимикробных агентов. Из литературы также известно, что основной мишенью фотодинамического повреждающего действия, как правило, является клеточная мембрана 57. Это позволило предположить, что данное явление может быть использовано в методе биолюминесцентного определения концентрации клеток 8 в качестве альтернативного пути экстракции внутриклеточного АТФ для увеличения его чувствительности и точности. Дело в том, что при определении концентрации АТФ биолюминесцснтным методом, микробные клетки предварительно разрушают, используя различные экстрагенты 9, кислоты, растворители или поверхностноактивные вещества. Светляковая люцифераза, используемая в биолюминесцентном анализе АТФ, довольно сильно ингибируется такими экстрагентами . Для уменьшения ингибирующего действия образец приходится разбавлять. Следует также учитывать, что наибольшая эффективность разрушения клеточной мембраны достигается при высоком отношении объема экстрагента к объему пробы, что, естественно, сильно уменьшает концентрацию АТФ в образце. Эти обстоятельства приводят к снижению чувствительности метода. Кроме того, данный метод позволяет количественно определить в первую очередь общую зараженность образца, но не зараженность определенным видом микроорганизмов. Определение же специфической обсемененности на фоне общей микробной зараженности объекта требует дополнительные подходы, приводящие к существенному усложнению методик и увеличению времени анализа . Тот факт, что сенсибилизаторы различного строения могут поразному взаимодействовать с микроорганизмами с различным строением клеточной стенки 4, , открывает перспективу селективного определения и стерилизации бактерий одного типа на фоне других. Грамотрицательных и Грамположигельных микроорганизмов в свете применения фотодинамического воздействия как способа стерилизации зараженных микробами объектов. Когда ароматическая молекула поглощает свет определенной энергии, она может подвергаться электронному переходу в синглетное возбужденное состояние спины электронов спарены. Затем в зависимости от молекулярной структуры и окружения молекула может потерять свою энергию под действием электронных или физических процессов, возвращаясь таким образом в основное состояние, или же перейти в триплетное возбужденное состояние спины электронов распарены. Па этом этапе молекула может снова вернуться в основное состояние, вступить в окислительновосстановительные реакции со своим окружением, или передать энергию возбуждения молекулярному кислороду тоже триплетной молекуле с образованием лабильного синглетного кислорода рис. Синглетным кислородом называют электронновозбужденные молекулы О2, находящиеся на одном из синглетных уровней и 1 Ае . Таким образом, отличается от других активных форм кислорода радикалы , Н, ОН или перекись водорода тем, что для его получения требуется лишь поглощение энергии без химической модификации кислородных молекул. Вообще говоря, перенос энергии от возбужденных молекул в триплетном состоянии является не единственным путем образования синглетного кислорода. Многочисленные исследования позволили выявить ряд элементарных физических и химических процессов, которые могут служить источником . В связи с тем, что синглетный кислород играет довольно важную роль в различных фотобиологических процессах, рассмотрим кратко некоторые из этих процессов, представляющие интерес для исследователей биологических систем.