Термодинамические и кинетические особенности ацилирования аминосоединений в водной среде, катализируемого пенициллинацилазой

• Автор: Ушаков, Геннадий Александрович
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Пенициллина циллзл

1.1.1 Общие сведения.

. 1.2 Стерео и субстратная специфичность ПА

1.1.3 Ферментативный гидролиз, катализируемый ПА

1.1.4 Неакшивированный ацильный перенос.

1.1.5 Активированный ацильный перенос.

1.2 Особенности строения и термодинамики амидной связи

1.2.1 Структурные особенности амидной сети.

1.2.2 Сравнение химических и ферментативных способов синтеза амидной связи

1.2.3 Термодинамика образования амидной связи. Влияние условий проведения реакции па

определяемую константу равновесия
1.2.4 Термодинамика амидной связи. Линейная корреляция свободной энергии образования
амидной связи с основностью аминосоединепия
1.2.5 Термодинамика амидной связи. Синтез антибиотиков.
1.2.6 Связь кинетических и термодинамических параметров.
ПОСТАНОВКА ЗАДАМИ.
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Материалы.
2.1.1 Список коммерческих реактивов
3.1.2 Химический синтез амидов.
2.2 Методы
2.2.1 ВЭЖХанализ.
2.2.2 Определение констант ионизации аминосоедипсний.
2.2.3 Определение констант равновесия гидролиза ряда ацильных доноров
2.2.4 Определение констант равновесия гидролиза амидов. производных фснилуксусиой кислоты
2.2.5 Определение активности пенициллинацизазы
2.2.6 Изучение растворимости компонентов реакции
2.2.7 Слсмсение за реакцией синтеза ацильных производных аминов и аминокислот.
2.2.8 Определение активности пснициллинацияазы
2.2.9 Синтез Хфснилацспшлпроизводных сложных эфиров аминокислот в гетерогенных системах
2.2 Синтез этилового эфира Хфснилацстилфснилшашша при различных температурах
2.2. Синтез галогензамещднных Хфснилацетил производных сюжных эфиров аминокислот
2.2. Определение растворимости ССфенилаланина и фснилуксусиой кислоты при различных концентрациях сульфата аммония.
2.2. Определение растворимости Хфснилацетияфспюапанина при различных концентрациях сульфата аммония.
2.2. Определение растворимости этилового эфира ССфспилалаиипа и этилового эфира Vфсиишцеппафепилапанииа в растворах с высокой высачивающей способностью.
2.2. Синтез Хфснилацатыфстскианина в растворах с высокой высаливающей способностью.
2.2. Определение активности пенициллинацилазы в растворах с различной ионной силой.
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1 ПРЯМАЯ КОНДЕНСАЦИЯ
3.1.1 Термодинамика прямой конденсации
.1.1.2 Использование реакции прямой конденсации в биотехнологии. Эффективное и стереоселективное ацилирование 1 фенилзтиламина в водной среде без активации ацильного
донора.
.1.1.3 Эффективное и стереосеяективное ацилирование эфиров аминокислот в водной среде без
активации ацильного донора.
3.2 активированный ацильный перенос.
3.2.1 Термодинамика активированного ацильного переноса
3.2.3 Анализ кинетической модели ферментативного ацильного переноса, не осложннного гидролизом ацилфермента.
3.2.4 Анализ равновесной кинетической модели активированного ацильного переноса с необратимым гидролизом ацилфермента
3.2.5 Анализ равновесной кинетической модели активированного ацильного переноса с равновесным гидролизом ацилфермента
3.2.6 Зависимость выхода активированного ацильного переноса от термодинамических и кинетических параметров
5 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
Список сокращений
ПА иенициллинацилаза
Ы1РАВ пнитромкарбоксианилид фенилуксусной кислоты
РИАс фенилуксусная кислота
РЬАгп амид фенилуксусной кислоты
РИОАс феноксиуксусная кислота
РЬОЛт амид феноксиуксусной кислоты
ЯМЛс Яминдальная кислота
КМат амид Яминдальной кислоты
ПС Ас гидрокоричная кислота
НСЛт амид гидрокоричной кислоты
ЯРСЛт амид Яфениглицина
ЯРОАс Яфенилглицин
8РЬС1уОН Бфенилглицинол
БРИеКТО амид 8фенилаланина
додеци л сульфат натрия
Жс свободная энергии
ас рНнезависимая составляющая свободной энергии
рНзависимая составляющая свободной энергии
от ацильный донор в реакции прямой конденсации
ЯМ аминокомпонент в реакции прямой конденсации
РО растворимость продукта
Введение


А не участвует в биосинтезе пенициллиновых антибиотиков циклизация в дипептиде цистеинвалин с образованием двух гетероциклов происходит при участии другого фермента изопенициллинсинтазы 7. Рис. Две амидных связи в пенициллиновых антибиотиках 1стабильная амидная связь, 2лабильная лактаиная связь. Для ПА из ii i первичная структура была определена методом секвенирования гена 8. Зрелый фермент из ii периплазматический гетеродимер, состоящий из а и цепей . Да и . Да, соответственно 8, которые получаются в результате активации общего мембранносвязанного предшественника . Рис. Рис. Общий вид гетеродимера пенициллинацилазы из ii, построенный на основании данных РСА. Усредненные размеры составляют xx А. Синим цветом показана асубъединица, красным субьединица фермента. В настоящее время определены первичные структуры ПА из i i , . Каталитическим центром во всех случаях является концевой серии цепи. Физиологическая роль ПА до настоящего времени не установлена. Существует несколько предположений резистентность к пенициллинам и метаболизирование ФУК в качестве единственного источника углерода и энергии ,6. Опубликованные в году данные по рентгеноструктурному анализу РСА ПА из ii, а также комплексов фермента с ФУК, фенилметилсульфонил фторидом 7 и другими ингибиторами позволили сформировать основные представления о структуре и г ипотезу о механизме каталитического действия данного фермента. Гетеродимер пенициллинацилазы состоит из двух тесно переплетенных цепей без очевидных дискретных областей с глубокой чашеобразной выемкой в центре Рис. Фенильная часть ингибитора направлена внутрь этого кармана, а карбоксильная группа взаимодействует с серином i. Специфичность фермента к фенилацетильной группе объясняется комплементарностыо фенилацетильного остатка и участка связывания ацильной группы субстрата активного центра фермента. В ранних работах по изучению ПА показано, что ФМСФ специфический реагент на гидроксильную группу серина ковалентно модифицирует ПА из ii , 9, . ПА, протекают через
образование ацилферментного комплекса . Позднее было найдено, что именно концевой 3цепи является нуклеофилом активного центра ПА замена i на цистеин сайтнаправленным мутагенезом ПА из ii или химической модификацией ПА из ii Г7 и . Анализ структуры продукта взаимодействия ПА с ФМСФ, ацилферментного комплекса феиилметилсульфонилПА, на основании данных РСА, подтвердил эти предположения и позволил авторам предложить ранее неизвестный механизм катализа, основанный на самоактивации концевого нуклеофила Рис. Раннее предположение о каталитически значимой роли остатка серина, следовавшее из кинетических данных и необратимом ингибировании фермента ПМСФ, в полной мере подтвердилось данными РСА. Более детальное рассмотрение позволило отнести А к новому семейства гидролаз, классу ферментов с общим мотивом активного
центра, содержащих каталитически активный или на конце , . Каталитический акт у ферментов этого семейства протекает, как и в традиционном случае катализа сериновыми и цистеиновыми гидролазами, через образование промежуточного ковалентного ацилфермента. Однако, в отличие от последних, усиление нуклеофильности килородасеры происходит не за счет протяженной цени переноса заряда, а благодаря близ расположенной собственной ааминогруппе концевой аминокислоты. В дальнейшем ацилфермент через стадию образования тетраэдрического интермедиата, стабилизированного водородными связями с атомами водорода амидных групп аспарагина и аланина , претерпевает последующие превращения Рис. Изначально предполагалось, что в ходе каталитического акта перенос атома водорода от кислорода гидрокси группы серина к концевому азоту серина происходит через мостиковую молекулу воды. Однако последние данные РСА комплекса ПА с близким аналогом природного субстрата косвенно свидетельствуют о том, что перенос протона от кислорода к азоту серина может проходить напрямую. Моделирование каталитического механизма ПА посредством квантовомеханических расчетов подтверждает возможность прямого переноса протона, а также важную роль концевой амидной группы Ь1 и амидной группы Ь пептидной цепи в стабилизации оксианионного интермедиата 2.