Лиганд-зависимое функционирование ангиотензин-превращающего фермента

• Автор: Скиргелло, Ольга Евгеньевна
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 181 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

I. СТРОЕНИЕ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЕГО ФЕРМЕНТА И ПРЕДПОЛАГАЕМЫЙ МЕХАНИЗМ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА СУБСТРАТОВ
И. СВОЙСТВА АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ Ы И СДОМЕНОВ СОМАТИЧЕСКОГО АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА ЧЕЛОВЕКА

II. 1. Субстратная специфичность С и Ыдоменов ангиотензинпревращающего фермента быка

.2. Взаимодействие активных центров ангиотензинпревращающего фермента с конкурентными ингибиторами
III. ХАРАКТЕР СОВМЕСТНОГО ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ В СОСТАВЕ СОМАТИЧЕСКОГО АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЕГО ФЕРМЕНТА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

IV. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

IV. 1. Материалы

У.2. Методы исследования

.2.1. Синтез аффинного сорбента
.2.2. Выделение и очистка соматического ангиотензинпревращающего фермента быка и человека
.2.3. Выделение и очистка тестикулярного ангиотензинпревращающего фермента быка и Сдомена АПФ человека
.2.4. Получение Ыдомена соматического ангиотензинпревращающего фермента
.2.5. Определение концентрации и чистоты выделенных препаратов фермента
.2.6. Кинетические измерения
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
V. ПОЛУЧЕНИЕ ТРЕХ ФОРМ АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА
VI. РОЛЬ ДЛИНЫ СУБСТРАТА ПРИ СОВМЕСТНОМ ФУНКЦИОНИРОВАНИИ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ СОМАТИЧЕСКОГО АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЕГО ФЕРМЕНТА
VI. 1. Гидролиз субстратов иод действием различных форм
ангиотензинпревращающего фермента человека и быка
VI. 1.1. Гидролиз трипептидных субстратов У.1.2. Гидролиз энкефалинов и ангиотензина I
V.2. Совместное функционирование активных центров соматического АПФ человека при гидролизе субстратов различной длины
У.2.1. Кинетический механизм совместного функционирования активных центров соматического ангиотензинпревращающего фермента человека
V.2.2. Количественная оценка ухудшения связывания второй молекулы субстрата с соматическим ангиотензинпревращающим ферментом человека
VI. СОВМЕСТНОЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ СОМАТИЧЕСКОГО АГФ ПРИ ПОДАВЛЕНИИ ЕГО АКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРАМИ РАЗЛИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
VI. 1. Подавление активности соматического ангиотензинпревращающего фермента лизиноприлом и кап топрилом короткими ингиби торами в реакциях гидролиза субстратов различной структуры
У.2. Подавление активности соматического ангиотензинпревращающего фермента длинным ингибитором
VI.2.1. Количественные характеристики связывания тепротида с соматическим ангиотензинпревращающего фермента быка
УН.2.2. Механизм ингибирования тепротидом реакций
гидролиза субстратов разной длины под действием соматического ангиотензинпревращающего фермента
У.З. Влияние ингибиторов промежуточной длины на активность соматического ангиотензинпревращающего фермента
УН.ЗЛ. Количественные характеристики связывания РР и РР 9 с ангиотензинпревращающим ферментом
УИ.3.2. Ингибирование РР и РР 9 активности
соматического ангиотензинпревращающего фермента
УН.4. Влияние длины ингибитора на механизм подавления активности соматического ангиотензинпревращающего фермента человека
VI 1.4.1. Ингибирование активности сомАПФч лизиноприлом при гидролизе субстратов различной длины
УП.4.2. Ингибирование активности АПФ человека тепротидом
при гидролизе субстратов различной длины
VIII. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА КАТАЛИТИЧЕСКОГО
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ МДОМЕНА С ПОМОЩЬЮ
МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
VIII. 1. Механизм ингибирования активности ангиотензин
превращающего фермента человека моноклональными
антителами ЗА5 и Н
УШ.2. Влияние лизиноприла на эффективность связывания антител с
доменом ангиотензинпревращающего фермента человека
УШ.З. Определение констант диссоциации комплекса
моноклональных антител ЗА5 и Н5 с АПФч в присутствии
лизиноприла
УШ.4. Моделирование структуры Мдомена по Сдомену
ангиотензинпревращающего фермента человека
УП1.5. Эпитопное картирование поверхности Ыдомена ангиотензин
превращающего фермента человека
УШ.6. Моделирование структуры Идомену ангиотензин
превращающего фермента человека по ангиотензин
превращающему ферменту II
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Однако при изменении концентрации С1 от 0 до мМ эффективность катализа нативной формой фермента при гидролизе ангиотензина I увеличилась в раз, а мутантной осталась неизменной. Аналогичные результаты были получены и для кишечной формы АИФ, соответствующей домену фермента, где, как было показано, решающую роль в активации галогенанионами играет остаток 0 . Значимость остатка при катализе АПФ авторы связывают с образованием фсрмснтСГсубсгратпого комплекса, при формировании которого происходят конформационные изменения активного центра фермента. При этом решающая роль отводится именно строению , поскольку его замена на похожий по структуре и по заряду остаток привела к гораздо меньшей зависимости эффективности катализа от концентрации С1 как в С, так и в домене АПФ . Особенности ферментативного катализа субстратов под действием активных центров АПФ авторы связывают с хлоридной зависимостью. Так, например, было отмечено, что гидролиз субстрата демонстрирует большую зависимость от концентрации С1, чем гидролиз субстрата . Это может свидетельствовать о том, что отсутствие отрицательного заряда на Сконце в случае первого субстрата компенсируется хлоридионами . Основываясь на высокой степени гомологии активных центров АПФ с другими, упомянутыми выше, протеазами, авторы предложили возможный ферментативный механизм гидролиза субстратов под действием АПФ. Структуру Сдомена АПФ в комплексе с лизиноприлом можно рассматривать как модель переходного состояния . На рисунке 1 представлен механизм гидролиза субстрата под действием какоголибо из активных центров АПФ. Атом цинка, выступая как основание Льюиса, оттягивает на себя часть электронной плотности от кислорода молекулы воды, тем самым облегчает образование связи между кислородом от молекулы воды и углеродом расщепляемой пептидной связи. С другой стороны активная группа ЕЗ 0 в СдоменеI2 в домене из iXXi мотива также благоприятствует нуклеофильной атаке активированной водой атома углерода расщепляемой амидной группы, образуя тетраэдрический интермедиат рис. Остаток , кроме того, способствует переносу протона от воды к атому азота атакуемой амидной связи, что делает образующийся амин хорошей уходящей группой. Кроме того, протонирование этого атома азота облегчается благодаря образованию водородной связи между первым атомом водорода рассматриваемой амидной группой и атомом кислорода группы В А1а2А1а0, а также благодаря правильной ориентации атома азота этой амидной группы, обеспечиваемой совместно с помощью групп Н1 ii9 и В рис. Аминокислота Н6 ii1 также играет важную роль в стабилизации переходного состояния через образование водородной связи с карбонильной группой в i положении, т. Группе 7 Туг,8Туг1 отводится ключевая роль в активации хлоридом активности С и доменов. Предполагается, что эта аминокислота стабилизирует отрицательный заряд кислорода i группы субстрата рис. Сдомена в комплексе с лизиноприлом рис. Итак, перечислим ключевые аминокислоты, участвующие в каталитическом расщеплении субстратов под действием С и доменов АПФ. Непосредственное окружение атома в активных центрах АПФ, образующих с участием молекулы воды тетраэдр, составляют остатки i9 i1, i3 i5 и I Сдомендомен. Нуклеофильную атаку расщепляемой пептидной связи осуществляют аминокислоты , А1а2А1а0, i,9i1 и Туг,8Пуг1. При этом, повидимому, все перечисленные аминокислоты необходимы как непосредственно для каталитического расщепления субстрата, так и для связывания субстрата, поскольку их мутация в большей или меньшей степени негативно воздействует на обе константы, и на ккат, и на Кт. АПФ. В работе авторы выделили несовпадающие аминокислотные остатки каждого из подсайтов активных центров в Сдомене и Ыдомене фермента табл. Таблица 1. Отличающиеся аминокислоты подсайтов активных центров С и Мдоменов ЛПФ нумерация по соматическомуАПФ . Рассмотрим подробнее как различия в строении активных центров АПФ отражаются на их функционировании при гидролизе субстратов и взаимодействии с конкурентными ингибиторами. Рис. Рис. Выравнивание первичных последовательностей Ыдомена и Сдомена АИФ человека.