Твердофазный изотопный обмен со спилловер-тритием в полипептидах и белке β-галактозидазе из Thermoanaerobacter Ethanolicus

• Автор: Дадаян, Александр Карэнович
• Шифр специальности: 02.00.14, 02.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Природа спилловсрводорода

Атомарная природа спилловерводорода

Нз частицы
Ионные пары
Н ионы
2.2. Термическая активация трития. Тритиевая планиграфия
2.3. Активация трития ВЧ разрядом
2.4. Реакция высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена
2.5. Исследование региоселективности изотопного обмена водородных атомов твердого органического соединения
2.6. Исследование механизма твердофазных реакций с использованием квантовохимического моделирования
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Материалы и приборы
3.2. Методы исследования
3.2.1. ВТКИО водорода на тритий
ВТКИО в пептидах
ВТКИО в белках
3.2.2. Очистка ргалактозидазы
Приготовление клеточных экстрактов
Фракционирование сульфатом аммония
Гельфильтрация
Анионобменная хроматография
3.2.3. Определение ферментативной активности ргапактозидазы и Рглюкозидазы
3.2.4. Определение концентрации белка
3.2.5. Подготовка белка к протеолизу
3.2.6. Гидролиз белка глутамилэндопептидазой из i ii
3.2.7. ВЭЖХ продуктов гидролиза ргалактозидазы.
3.2.8. Определение радиоактивности растворов
3.2.9. ЯМРспектроскопия
3.2 Методика iii расчетов.
3.2 Определение доступности СН связей в аконотоксине 1
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Исследование твердофазного изотопного обмена в пептидах
4.2. Исследование твердофазного изотопного обмена в белках
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
ПРИЛОЖЕНИЕ А
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Исследование взаимодействия твердого органического соединения с СВ при ВТКИО представляет как теоретический, так и практический интерес. С помощью этого эффективного и универсального метода получены кратно меченные тритием физиологически активные соединения. В связи с этим представляется актуальным выяснение основных закономерностей твердофазной реакции пептидов и белков с участием спилловертрития и исследование влияния пространственной организации полипептидов на реакционную способность их фрагментов при ВТКИО. Квантовохимические расчеты выполнены под руководством и при участии профессора д. Ю.А. Борисова ИНЭОС РАН. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Цели н задачи исследования. Цель настоящей работы изучение реакции ВТКИО в пептидах и белках. Научная новизна. Впервые исследовался механизм реакции ВТКИО в пептидах и белках. Показано влияние первичной, вторичной, третичной и четвертичной структур полипептидов на реакционную способность их фрагментов. Определены оптимальные условия реакции ВТКИО, позволяющие получать высокомеченые белки с полным сохранением ферментативной активности. Практическая ценность результатов работы. В результате проведенной работы были получены высокомеченные тритием пептиды и белки, использованные в экспериментах по специфическому связыванию, распределению и биодеградации в тканях. Показана перспективность использования ВТКИО для получения информации о пространственном взаимодействии полипептидов в белковых комплексах. Исследовано влияние состава твердой фазы и параметров реакции ВТКИО на включение трития и сохранение ферментативных свойств белков. ВТКИО, позволившие получить высокомеченый белковый ингибитор ангеотензинпревращающего фермента кДа с молярной радиоактивностью 0 Киммоль, полностью сохранивший свойства нативного белка. Реакцией ВТКИО получен меченный тритием инсулин, который был использован для исследования возможности создания пероральной лекарственной формы инсулина. Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на седьмой Всероссийской конференции по металлоорганической химии Москва, , седьмом международном симпозиуме i ii Ii Дрезден, Германия, , седьмом международном симпозиуме i i i Вена, Австрия, август г. Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии Москва, , , в двух докладах на третьем съезде Биохимического общества СПетербург, . В завершенном виде работа была доложена на заседании ученого совета Института молекулярной генетики РАН апреля года. Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в отечественной и зарубежной печати, тезисы 7 докладов. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Взаимодействие активированного водорода с твердым органическим веществом. В гетерогенном катализе спилловером называют транспорт активных частиц, сорбированных или образованных на одной фазе, на другую фазу, которая в данных условиях не сорбирует или не образует эти частицы Термин спилловер от английского i v перетекать был введен Бударом и сотр Фаза, генерирующая активные частицы, носит название инициатора или активатора, а фаза, предоставляющая места для адсорбции активных частиц, акцептора. Если эти фазы находятся в непосредственном контакте, то спилловер считается первичным, если же они разделены дополнительным инертным носителем вторичным. Первые непосредственные доказательства спилловера были получены, повидимому, в работе Хубиара при восстановлении трхокиси вольфрама до вольфрамовой бронзы при комнатной температуре2. Известно, чпго 3 восстанавливается водородом при температурах выше 0С с образованием оксида синего цвета. Если же чистый Н2 пропускать над механической смесью 0. На механической смеси I23 3 такого эффекта не наблюдается. Эго объясняют тем, что водород диссоциирует на и мигрирует через А0з на 3 в виде атомов или ионов Н. Явление спилловера широко распространено в катализе нанесенными металлами и смешанными оксидами. Эффект спилловера наблюдается не только с атомами водородаЗЛ5,67, но и кислорода 7Л, азота5,9, а также с частицами СО,, 5, и некоторыми другими 5. Большая часть опубликованных к настоящему времени статей на эту тему посвящена спилловеру водорода.