Олиго(2`-O-метилрибонуклеотиды), содержащие терминальную 3`-3`-межнуклеотидную связь, и их конъюгаты: синтез и свойства

• Автор: Новопашина, Дарья Сергеевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 202 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ 0ЛИГ

МЕТИЛРИБОНУКЛЕОТИДОВ Обзор литературы

1.1. Метилрибонуклеотиды минорный компонент природных РНК

1.2. Свойства олигометилрибонуклеотидов

1.2.1. Конформация рибозы в олиго2г0метилрибонуклеотидах и их

дуплексах

1.2.2. Стабильность комплексов олиго0метР1лрибонуклеотидов с НК

1.2.2.1. Стабильность дуплексов олигомстилрибонуклеотидов с ДНК

1.2.2.2. Стабильность триплсксов олигометилрибонуклеотидов с

1.2.2.3. Квадруплексы с участием олигометилрибонуклеотидов

1.2.3. Устойчивость олигомстнлрибонуклеотидов к действию
нуклеаз
1.3. Конъюгаты олигометилрибонуклео гидов
1.3.1. Конъюгаты олигометилрибонуклеотидов с рспортсриыми
группировками
1.3.1.1. Конъюгаты олиго2,0метилрибоиуклеотидов с биотином
1.3.1.2. Конъюгаты олигометилрибонуклеотидов с флуоресцентными
группировками
1.3.2. Конъюгаты олигомсти.чрибонуклсотидов со стероидами
1.3.3. Конъюгаты олигомстилрибонуклеотидов с
интеркалирующими группировками
1.3.4. Конъюгаты олнгометилрибонуклеотидов с
релкционноспособными группировками
1.3.4.1. Конъюгаты олиго2,0метилрибонуклеотидов с алкшшруюшими
группировками
1.3.4.2. Конъюгаты олиго2,0мстилрибонуклсотидов с
фоторсакционноспособными группировками
1.3.5. Конъюгаты олиго2,0метючрибонуклеотидов с пептидами
1.3.6. Конъюгаты олигометшфибонуклеотидов с комплексами
металлов
1.3.7. Радиоактивно меченые конъюгаты олиго2Ч
метилрибонуклеотидов
1.4. Применение олнгометнлрибонуклеотидов и их конъюгатов
1.4.1. Аффинная хромато1рафггя РНК и РНКбелковых комплексов
1.4.2. Изучение и регуляция процессов сплайсинга
1.4.3. Локализация РНК в клетке
1.4.4. Изучение пространственной структуры РНК
1.4.5. Ингибирование экспрессии генов
1.4.5.1. Антисенсподход
1.4.5.2. Антигенподход
1.4.5.3. Олигометилрибоиуклеотиды как эффекторы при воздействии
на структурированные РНК
1.4.6. Изучение механизма действия мнкроРНК и з1РНК
1.4.7. Конструирование функциональных НК с использованием
метилрибонуклеозидов
Глава 2. 0ЛИГ0МЕТ1ШРИБ0НУКЛЕ0ТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ
ТЕРМИНАЛЬНУЮ ЗЗМЕЖНУКЛЕОТИДНУЮ СВЯЗЬ, И ИХ КОНЪЮГАТЫ
СИНТЕЗ И СВОЙСТВА Результаты и обсуждение
2.1. Синтез олигометилрибонуклеотидов, содержащих
терминальную ЗЗмежнуклеозидную фосфоднэфирную связь
2.1.1. Получение полимерных носителей с присоединенными 3
димстокситритил дезоксирибонуклсозндамн
2.1.2. Твердофазный синтез олигометилрибонуклсотидов,
содержащих терминальную ЗЗмежнуклеозидную фосфоднэфирную связь
2.2. Исследование устойчивости олигометилрибонуклеотидов, содержащих терминальную ЗЗмежнуклеозидную фосфоднэфирную связь, к действию нуклеаз
2.3. Изучение структуры и стабильности комплексов олиго
метилрнбонуклеотидов, содержащих терминальную ЗЗмежнуклеозидную фосфоднэфирную связь, с нуклеиновыми кислотами
2.3.1. Структура и стабильность дуплексов олиго
метилрнбонуклеотидов, содержащих терминальную ЗЗмежнуклеозидную фосфоднэфирную связь
2.3.2. Стабильность триплексов олигометилрибонуклеотидов,
содержащих терминальную ЗЗмсжнуклсозидную фосфоднэфирную связь, с двуцепочечной ДНК
2.4. Синтез и изучение свойств химерных
метилрибодезоксирнбоолигонуклеотидов, содержащих терминальную ЗЗмежнуклеозидную фосфоднэфирную связь
2.5. Синтез и изучение свойств конъюгатов олиго
метилрнбонуклеотидов, содержащих терминальную ЗЗмежнуклеозидную фосфоднэфирную связь
2.5.1. Фотоактивируемые конъюгаты олигометилрибонуклеотидов и 3 их 3шшертированных аналогов
2.5.1.1. Синтез фотоактивирусмых конъюгатов олигометилрибонуклеотидов и их 3пнвертированпых аналогов
2.5.1.2. Свойства фотоактивнруемых конъюгатов олигометилрибонуклеотидов и их 3инвертированных аналогов
2.5.2. Синтез и свойства 5пиренилметилфосфамидных и 5биепирснилметилфосфоднамидных конъюгатов олигометилрибонуклсо гидов, содержащих терминальную ЗЗмежиуклсозидиую фосфоднэфирную связь
2.5.2.1. Синтез конъюгатов олигометилрибонуклеотидов и их 3инвертнрованных аналогов с пиреном
2.5.2.2. Свойства 5пирсшльньх конъюгатов олигометилрнбонуклсотидов и их 3инвертированных аналогов
2.5.3. Конъюгаты олигометилрибонуклеотндов и их
инвертироваиных аналогов с лигандами малой бороздки дизайн, синтез и изучение свойств
2.5.3.1. Синтез конъюгатов олигометилрнбонуклсотидов и их 3
инвертированных аналогов с лигандами малой бороздки
2.5.3.2. Стабильность триплексов конъюгатов олиго
метилрнбонуклеотидов и их 3ишертировашьх аналогов с лигандами малой бороздки с дцДНК
Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Исходные материалы
3.2. Основные методы работы
3.3. Методики эксперимента
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Относительно недавно было обнаружено свойство богатых последовательностей нуклеинов,IX кислот, таких, например, как теломерные повторы ,, или мнкросателлитпые последовательности , образовывать внутри или межмолекулярные квадруплексы ые структуры с образованием квартетов рис. В настоящее время повышенный интерес исследователей к квадруплсксным структурам объясняется их потенциальной биологической ролыо i viv. Раисе было показано, что многие биологически важные богатые последовательности способны образовывать квлртеты в физиологических условиях Ш vi . Рис. Сквартет, образованный четырьмя гуанозинами. ОБогатые последовательности олигонуклеотидов способны формировать несколько возможных структур квадруплексов в зависимости от термодинамических и кинетических условий, таких как последовательность нуклеозидов в олигомере, концентрация олигонуклеотида, температура и состав буфера, , присутствие ионов К и На. Квадруплексы могут быть сформированы одной, двумя или четырьмя молекулами олигонуклеотида рис. Мономерные и димерные квадруплексы классифицируют в зависимости от расположения соединительных петель на квадруплексы типа кресло, имеющие поперечную петлю, и квадруплексы типа корзина, имеющие диагональную петлю. Относительная ориентация четырех цепей квадруплекса может быть параллельной, как, например, в случае тстрамера, антипаралельной, как в случае квадруплексов типа кресло и смешанной, как в случае квадруплексов чипа корзина . Рис. Структуры квадруплексов . В работе была впервые продемонстрирована способность олигометилрибонуклеотидов и смешанных метилрибодезоксирибоолигомеров формировать димерные квадруплексы типа кресло. Введение метилыюй группы в олигонуклеотиды значительно изменяет глубину и форму бороздок квадруплекса. Все четыре бороздки становятся отличными друг от друга, глубина бороздок при этом уменьшается с 5 А до А. Такое изменение структуры комплекса значительно снижает его биологическую активность. Квадруплексы олигомстилрибонуклеотидов не влияли на пролиферацию клеток НсЬа, в то время как их дсзоксирибоаналоги активно ингибировали ее. Однако, шпилечные Обогатые олигометилрибонуклеотиды, формирующие димерные квадруплексы типа корзина , а также тетрамерные квадруплексы , проявили высокую антиВИЧ активность. Квадруплексы олигометилрибонуклеотидов являются интересным объектом исследований, а положительные результаты, полученные с их использованием, позволяют предполагать о возможном их применении в качестве терапевтических препаратов. Важно отметить, что олигонуклеотиды, формирующие квадруплексы, обладают большой устойчивостью к действию нуклсаз благодаря сложной вторичной структуре . Стабильность олигометилрибонуклеотидов к действию нуклеаз будет рассмотрена в следующем разделе. Олигометилрибоиуклеотиды устойчивы к действию РНК и ДНКспецифических нуклеаз, но гидролизуются некоторыми ну кл саза ми двойного спектра действия фосфодиэстераза змеиного яда, нуклсаза Р1, микрококковая нуклсаза 2, , . Важно отметить, что олигометилрибоиуклсотиды гидролизуются этими нуклеазами со значительно меньшей скоростью, чем рнбо и дезоксирибоолигомеры. Скорость деградации олигометилрибонуклеотидов нуклеазами сыворотки значительно меньше, чем скорость деградации их рибо и дезокирибо аналогов в тех же условиях . Дуплексы мстилРНКмстнлРНК также более устойчивы к действию экзо и эндонуклеаз сыворотки, чем аналогичные РНКРНК дуплексы . Важно отмстить, что дуплексы олигометилрибонуклеотидов с РНК не расщепляются РИКазой П . Эти метилРНКРИК дуплексы имеют структуру, очень близкую по геометрии к стандартной Аформе РНКРНК дуплексов, в то время как РНКаза II связывается с гибридным ДНК РНК дуплексом, имеющим промежуточную между А и Вформой структуру. Кроме того, в комплексе метилРНКРИК 2метокепгруппа направлена в малую бороздку дуплекса , с которой взаимодействует РПКаза И. Этими двумя фактами можно объяснить неспособность РНКазы Н узнавать дуплексы олгометилрибонуклеотидов с РНК и катализировать расщепление РНК. Высокая устойчивость олигометилрибонуклеотидов к действию нуклеаз позволяет считать их перспективными терапевтическими агентами и хорошей основой для создания диагностических зондов.