Физико-химические свойства и механизм расщепления РНК соединениями, не содержащими функциональных групп, катализирующих реакцию трансэтерификации

• Автор: Ковалев, Николай Алексеевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 126 с. : ил.

Введение

Глава 1. Роль гидрофобных взаимодействий в РНКбелковых комплексах Обзор

литературы

1.1 Характеристика ван дер Ваальсовых и стэкингвзаимодействий

1.2. Общие закономерности образования РНКбелковых контактов

1.3. Роль гидрофобных взаимодействий в связывании РНК различными белками

1.3.1. Часто встречающиеся РНКсвязывающие мотивы

1.3.1.1. РНКраспознающий мотив

1.3.1.1.1. 1А и 2 белки

1.3.1.1.2. в комплексе с ДНК

1.3.1.2. Мотив, связывающийся с двухцепочечной РНК

1.3.1.2.1. в РНКазе III
1.3.1.2.2, в белке
1.3.1.3. Кгомологичный КН домен
1.3.1.3.1. КН домен в белке 1
1.3.2. Рибосомные белки
1.3.2.1. Взаимодействие 5 рРНК с рибосомными белками
1.3.3. Белки, взаимодействующие с тРНК
1.3.3.1. Образование псевдоуридина из уридина
1.3.3.2. Взаимодействие тРНК с аминоацилтРНКсинтетазами
1.3.4. Белкирегуляторы различных процессов в жизненных циклах клетки и вирусов
1.3.4.1. белок
1.3.4.2. Белок оболочки вируса 2
1.3.4.3. Роль гидрофобных взаимодействий в узнавании кэпированной РНК и инициации трансляции
1.3.4.4. Белки, связывающиеся с РНК
1.3.4.5. Гидрофобные взаимодействия при связывании белков с I
1.3.4.6. Антитерминация транскрипции в фаге X
1.3.4.7. Роль гидрофобных взаимодействий в токсичности рицина
1.3.5. Роль гидрофобных взаимодействий во взаимодействии РНКаз с РНК
1.3.5.1. РНКазаЕ
1.3.5.2. РНКаза I
1.3.5.3. РНКаза Т1
1.3.5.4. РНКаза Р
Заключение
Глава 2. Экспериментальная часть
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы и препараты
2.1.2. Плазмиды
2.1.3. Олигорибонуклеотиды и РНК
2.1.4. Буферные растворы, использованные в работе
2.2. Методы
2.2.1. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
2.2.2 Исследование комплексов 2 с использованием светорассеяния
2.2.2.1 Определение критической концентрации мицеллообразования 2
2.2.2.2 Исследования кинетики взаимодействия i2 с РНК
2.2.2.3 Определения молекулярных параметров комплексов 2 РНК
2.2.3. Получение РНК с помощью реакции транскрипции i vi
2.2.3.1. Получение линейной формы плазмиды
2.2.3.2. Транскрипция i vi
2.2.3.3. Очистка РНКтранскриптов
2.2.4. Введение Рметки по 5концу РНК
2.2.5. Частичный гидролиз РНК в денатурирующих условиях
2.2.6. Расщепление РНК искусственными рибонуклеазами
2.2.7. Измерение кинетических параметров реакции расщепления олигонуклеотида ОЫ в присутствии или в отсутствие веществ, ускоряющих расщепление
3. Глава 3. Физикохимические свойства и механизм расщепления РНК соединениями, не содержащими функциональных групп, катализирующих реакцию трансэтерификации Результаты и обсуждение
3.1. Общая структура новых искусственных рибонуклеаз
3.2. Структура РНКмишеней, использовавшихся в работе
3.3. Комбинаторные библиотеки химических рибонуклеаз
3.3.1 Дизайн и синтез комбинаторных библиотек
3.3.2. Рибонуклеазная активность комбинаторных библиотек
3.3.2.1. Рибонуклеазная активность полных библиотек
3.3.2.2. Рибонуклеазная активность усеченных комбинаторных библиотек
3.4. Сравнение рибонуклеазной активности индивидуальных соединений Эрб, Эр , Ир2 и детергентов
3.4.1. Свойства новых искусственных рибонуклеаз
3.4.2 Зависимости степени расщепления РНК от концентрации искусственных рибонуклеаз
3.4.3. Кинетика расщепления РНК искусственными рибонуклеазазми
3.4.4 Расщепление РНК в присутствии детергентов
3.4.5. Определение констант скорости расщепления РНК
3.5 Влияние условий реакций на расщепление РНК соединением Ор
3.5.1. Влияние на скорость расщепления РНК соединением Эр
3.5.2. Влияние концентрации имидазола
3.5.3. Обсуждение влияния и имидазола
3.5.4. Влияние буфера
3.5.5. Влияние одновалентных катионов
3.5.6. Обсуждение влияния буферов и одновалентных катионов
3.5.7. Синергизм в расщеплении РНК соединением Эр
3.6 Изучение взаимодействия молекул Эр с фрагментами РНК различной длины методом статического и динамического светорассеяния
3.6.1 Определение критической концентрации мицеллообразования Ир
3.6.2 Исследования кинетики взаимодействия Эр с РНК
3.6.3 Определения молекулярных параметров комплексов Ор РНК
3.7. Сиквенсспецифичность расщепления РНК соединениями Эр и Ор2
3.8. Предположительный механизм расщепления РНК соединением Ор
Выводы
Список литературы


Жизненный цикл любой молекулы РНК начинается с процесса транскрипции синтеза РНК на матрице ДНК и заканчивается ее расщеплением внутриклеточными РНКазами. Во время жизненного цикла каждая молекула РНК участвует во множестве процессов, зависящих от ее типа. Так, премРНК подвергается копированию, полиаденилированию, сплайсингу, и полученная мРНК в дальнейшем участвует в процессе трансляции в качестве матрицы при синтезе белков. РНК подвергается сплайсингу, посттранскрипционной модификации оснований, и участвует в аминоацилировании и биосинтезе белка в качестве переносчика аминокислот. РНК, наряду с функцией каркаса при сборке рибосом, участвуют также в формировании каталитических центров рибосомы и синтезе белка. РНК малые ядерныс РНК образуют сплайсосомы частицы, участвующие в сплайсинге. Кроме того, в последние годы обнаружены миРНК малые интерферирующие, микроРНК, внеклеточные РНК, функции которых активно исслеуются. Во всех вышеперечисленных процессах РНК образуют комплексы с различными белками, которые образованы за счет наличия большого числа слабых связей между молекулами РНК и белка. При этом происходит взаимное изменение пространственной структуры взаимодействующих молекул с образованием наиболее продуктивного комплекса. Два основных вида слабых взаимодействий, участвующих в стабилизации РНКбелковых комплексов, это водородные связи, образуемые полярными группами молекул, и ван дер Ваальсовы взаимодействия, образуемые гидрофобными частями молекул. Водородные связи возникают между группой донором атома водорода и группой акцептором см. Ван дер Ваальсовы взаимодействия в физиологической среде уменьшают контакты гидрофобных групп с водой, путем группировки их между собой. В настоящем обзоре будут рассмотрены гидрофобные контакты белков с РНК, выявлены общие черты этих контактов, их функции, а также показана важная роль гидрофобных контактов для правильного протекания большинства биохимических и молекулярнобиологических процессов. Первичная структура полимерных молекул в клетке белков и нуклеиновых кислот определяется комбинацией структурных блоков аминокислот и нуклеотидов, соответственно, которые связаны между собой. Вторичная и третичная структура молекул то есть их пространственная форма определяется именно слабыми взаимодействиями. В результате реализации таких взаимодействий происходит переход молекулы биополимера в более компактную форму. Межмолекулярные слабые взаимодействия между атомами реализуются при образовании различных комплексов. Например, узнавание субстрата ферментом происходит благодаря наличию слабых межмолекулярных связей. Таким образом, слабые взаимодействия играют важную роль во всех процессах, в которых участвуют биополимеры. К слабым взаимодействиям относятся ван дер Ваальсовы и водородные связи. Они относятся к слабым, поскольку подобные связи значительно менее прочны чем ковалентные связи. В случае ван дер Ваальсовых взаимодействий эта энергия складывается из трех составляющих энергии дипольдипольных взаимодействий, энергии взаимодействий типа дипольиндуцированный диполь и энергии дисперсионных взаимодействий . Все эти составляющие обратно пропорциональны расстояниям между взаимодействующими атомами. При уменьшении расстояния между атомами энергия их взаимодействия увеличивается рис. Следовательно, существует такое расстояние, на котором эти силы равны по модулю, причм состояние такого равновесия устойчивое. Такое расстояние называется ВандерВаальсовым радиусом рис. А. Любую молекулу рис. Б можно поместить в оболочку, отражающую поверхность, на которой ван дер Ваальсовы взаимодействия максимальны, причм эта поверхность будет проходить на расстоянии ван дер Ваальсовых радиусов для соответствующих атомов. Как можно подсчитать, энергия таких взаимодействий ненамного больше тепловой 0. Т0 К, поэтому ван дер Ваальсовы связи при физиологических температурах становятся эффективными, когда взаимодействует большое количество атомов. Именно это и наблюдается в молекулах биополимеров, где при образовании пространственной структуры, например белка, взаимодействует множество различных атомов.