Химический синтез длинных олигодезоксирибонуклеотидов N-метилимидазолидным фосфотриэфирным методом в растворе

• Автор: Ревердатто, Сергей Владимирович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1985
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 184 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава I. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ХИМИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ОЛИГ 0ДЕКСНРИБ0НУКЛЕ0Т ИДОВ

Обзор литературы

1.1. Развитие химических методов синтеза олигодезоксирибонуклеотидов.

1.2. Защитные группы в химическом синтезе олигодезоксирибонуклеотидов.

1.2.1. Защита гетероциклических оснований

1.2.1.1. Блокирование экзоциклических аминогрупп.

1.2.1.2. Защита оксо и иминофункций остатков

1.2.2 Защита гидроксильных групп дезоксирибозы .

1.2.3. Защита фосфатных групп

1.3. Создание межнуклеотидной связи
1.3.1. Фосфотриэфирный метод.
1.3.2. Фосфитный метод.
1.4. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов
растворным методом .
1.5. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов на
твердой фазе.
1.6. Удаление защитных групп, выделение и очистка полученных олигодезоксирибонуклеотидов, доказательство их структуры .
1.6.1. Удаление защитных групп.
1.6.2. Выделение и очистка синтетических олигодезоксирибонуклеотидов .
1.6.2.1. Хроматографические методы.
1.6.2.2. Электрофорез в полиакриламидном геле . .
Стр.
1.6.3. Анализ структуры синтетических олигодезоксирибонуклеотидов.
Глава И. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ДЛИННЫХ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ
Обсуждение результатов.
Глава Ш. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Ш.1. Материалы.
I.I.I. Растворители
Ш.1.2. Реактивы.
Ш.1.3. Сорбенты .
Ш.2. Оборудование.
Ш.З. Методы . . ,.
Ii.3.1. Получение 50защищенных дезоксирибонукле
озидов.
Ш.3,2. Получение зиЭбензоилацилдезоксирибонук
леозидов.
Ш.3.3. Получение защищенных МОНОЩКЛеОТИДОВ
Ш.З.4. Получение динуклеотидных блоков
Ш.З.5. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов .
Ш.З.6. Получение полностью деблокированных
олигодезоксирибонуклеотидов
Ш.3.7. Выделение олигонуклеотидов после полного
удаления защитных групп
ЛИТЕРАТУРА


Большим достоинством диэфирного метода было достигнутое удачное соответствие между использовавшимися защитными группами и применявшимися конденсирующими реагентами последние были достаточно активны для образования мекнуклеотидной связи, но не для модификации гетероциклических оснований см. Кроме того, щелочная обработка, использовавшаяся при селективном удалении защитных групп, не создавала никаких проблем, связанных с депуринизацией гетероциклических оснований. С диэфирным методом связаны первые большие достижения олигонуклеотидного синтеза расшифровка генетического кода, синтез ряда генетических структур, в том числе полных генов см. Однако к концу х годов возможности роста этого метода были исчерпаны и встал вопрос о поиске иных способов получения олигодезоксирибонуклеотидов. К недостаткам описанной схемы следует отнести в первую очередь большую трудоемкость и длительное время от нескольких часов до нескольких дней, затрачиваемое на каждый этап наращивания олигонуклеотидной цепи. Кроме того, незащищенные межнуклеотидные фосфатные группы в ходе конденсации образуют пирофосфаты с активированным фосфатным нуклеотидным компонентом реакции, что вынуждает прибегать к тем большим избыткам последнего, чем длиннее наращиваемая цепь, а соответственно, и к большим избыткам конденсирующих реагентов. В присутствии конденсирующего реагента сама мекнуклеотидная фосфодиэфир
на я группа может быть активирована и дать начало росту дополнительной цепи с образованием так называемых разветвленных олигонуклеотидов. Наконец, большой проблемой является высокая полярность молекулы олигонуклеотида и связанная с этим низкая растворимость в большинстве органических растворителей. Решить эти проблемы можно используя фосфотриэфиры, как это впервые было предложено А. Тоддом. Б этом методе, получившем название триэфирного, в межнуклеотиный фосфатный остаток вводится дополнительная защитная группа и тем самым растущая олигонуклеотидная молекула становится электронейтральной. Долгое время однако в этом методе не было приемлемого способа создания мекнуклеотидной связи предложенная Тоддом схема с использованием хлорфосфатов см. Кораной концепция активации фосфата i i требовала применения более мощных конденсирующих агентов, чем применявшиеся в диэфирном методе. Такие реагенты тетразолиды ,ароматических сульфокислот, предложенные в году С. Нарангом с сотрудниками, позволили значительно уменьшить время реакции конденсации, повысить ее выход и в целом, наряду с использованием концепции универсального блока см. I.3. I, превратили триэфирный метод в один из основных источников олигонуклеотидов для современной биохимии. Но новый метод принес с собой и новые проблемы. Мощные конденсирующие и фосфорилирующие реагенты
вызывают протекание побочных реакций по гетероциклическим основаниям, в особенности тиминовым и гуаниновым АОМ, ЧТО в ряде случаев приводит к низким выходам олигонуклеотидов, к тому же сильно модифицированных. Применение кислотной обработки на каждом этапе наращивания цепи для селективного удаления защитной диметокситритильной группы использование щелочнолабильных ацильных 0защитных групп, как в диэфирном синтезе, ведет при их удалении также к частичному отщеплению защитных групп межнуклеотидных фосфатных остатков вызвало другую проблему значительную депуринизацию, особенно адениновых оснований. Это отчасти связано также с большей кислотолабильностью гликозидных связей триэфиров нуклеотидов по сравнению с диэфирами. Еще одной проблемой является расщепление и изомеризация мекнуклеотидных связей при удалении фосфорных защитных групп на конечном этапе синтеза. БЫТггруппы, уменьшающих депуринизацию. Идет поиск более селективных конденсирующих реагентов и способов их применения, поиск новых фосфатных защитных групп, новых реагентов и условий для их удаления. Следует сказать, что синтез олигонуклеотидов можно проводить как. В этом случае отпадает необходимость хроматографирования на каждом этапе наращивания цепи и выделение олигонуклеотида после реакции сводится к простому фильтрованию.