Фотосенсибилизированная модификация ДНК-полимераз в реконструированных ансамблях белков и в экстрактах клеток и ядер

• Автор: Лебедева, Наталья Александровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 111 с.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Методы высокоселективной модификации ДНКс вязы воющих ферментов в реконструированных системах и экстрактах

1.1. Классическая аффинная модификация

1.2. Фотоаффинная модификация

1.3. Каталитнчески компетентное мечение

1.4. Каталитически компетентное меченне инициирующего комплекса РНКполимеразы ii i

1.5. Каталитически компетентное мечение ДНКполимераз

1.6. Фотомолификация с переносом энергии

1.7. Фотосенсибилизированнаи модификации белковпереносчиков лекарств

1.8. Бинарная система фотоаффинных реагентов

1.9. Бинарная система фотоаффинных реагентов для селективной модификации ДНКполимераз
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2.1. Введение Рметки в 5 конец олигонуклеотида
2.2.2. Подготовка ДНКдуплекса к синтезу ДНК. катализируемому ДНКполимеразами
2.2.3. Электрофорез по Леммли
2.2.4. Количественная обработка гелей
2.2.5. Выделение рекомбининтнойДНКполимеразы i
2.2.6. Синтез ДНК. катализируемый ДНКполимеразой или ДНКполимеразои i
2.2.7. Определение кинетических параметров
2.2.8. Фотосенсибизизированная модификация ДНКполимеразы i в присутствии
2.2.9. Фотоаффинная модификация ДНКполимераз
2.2 Условия УФоблучения
2.2 Оценка эффективности и селективности модификации ДНКполимераз
2.2 Выделение ядерного экстракта из семенников крупного рогатого скота
2.2 Синтез ДНК. катализируемый ДНКполимеразами ядерного экстракта
2.2 Фотоаффинная модификация белков ядерного клеточного экстракта
2.2 Иммуноанализ антителами против белков репарации
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬ ТА ТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Высокоселективная фотоаффинная модификация ДНКполимераз
. 1.1. Структуры и фотохимические характеристики аналогов
3.1.2. Фотосенсибилизированная модификация ДНКпопимеразы i из i В
3.1.3. Влияние природных на фотосенсибилизированную модификацию ДНКпомшвразы i
3.1.4. Селективная модификация ДНКполимеразы i в присутствии
3.1.5. Селективная модификация ДНКполимеразы апраймазы
3.2. Повышение эффективности модификации ДНКполимераз при использовании бинарной системы фотоаффннных реагентов
3.2.1. Субстратные свойства
3.2.2. Влияние структуры матрицы на эффективность модификации ДНКполимеразы Р
3.2.3. Влияние структур реагента и сенсибилизатора на эффективность модификации ДНКполимеразы р
3.2.4. Фотоаффинное мечение ДНКполимераз бинарной системой фотоаффинных реагентов в условиях кратного избытка реакционноспособного праймера
3.3. Идентификация белков в ядерном экстракте методом фотоаффиниой модификации с использованием различных фотореагентов
3.3.1. Структуры ДНК и фотореагентов, использованных в работе
3.3.2. Синтез фотореакционноспособных интермедиатов репарации оснований
3.3.3. Фотомодификация белков ядерного экстракта
3.4. Применение бинарной системы фотореагеитов для модификации белков в ядерном экстракте
3.4.1. Фотоаффинная модификация белков ядерного экстракта с использованием различных ДНКструктур
3.4.2. Сравнение набора продуктов модификации в меточном и ядерном экстрактах
3.4.3. Относительная селективность и эффективность модификации ДНКполимеразы 3 в ядерном экстракте
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
РСА рентгеноструктурный анализ УФсвет ультрафиолетовый свет ПААГ полиакриламидный гель ЭФ электрофорез
Трис трисгидроксиметиламинометан
ЭяКа додецилсульфат натрия
ТЕМЕД Ы,К,К,Ытетраэтилэтилендиамин
ПСА персульфат аммония
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭТТ дитиотреитол
1РТС изопропилРПтиогадактозид
РМБР фенилметилсульфонилфторид
НереБ Ы2гидроксиэтилпиперазинЫ2этансульфоновая кислота
ДНК нуклеиновая кислота
РНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ШТР дезоксирибоуридин5трифосфат
РАВбСТР экзоК2разидотетрафторбензамидоэтилдезоксирибоцитидин5трифосфат
РАР8ШТР азидо2,5дифтор3хлорпиридин6ил3аминопропионилюранс3аминопропенилдезоксирибоуридин5трифосфат 5Ц2нитро5азидобензоилтрсжс3аминопропенил1 2дезоксирибоуридин5трифосфат
РАВ4с1ШТР 5М2,3,5,6тетрафтор4азидобензоилланс3аминопропенил1 2,3 дидсзоксирибоуридин5трифосфат
РАВ4ШТР 5Н2,3,5,6тсграфтор4азидобензоилтас3аминопропенил дезоксирибоуридин5трифосфат
РАВ9ШТР 5НН2,3,5,6тетрафтор4азидобензоил 4аминобтирил транс3 аминоропенилдезоксирибоуридин5трифосфат
Руг8иТР 5Ы4 1 пиренилбутилкарбониламинояанопропенил1 2дезоксирибоуриднн5гтрифосфат
Руг6сШТР 5РЦ4 1 пиренилэтилкарбонил3аминояянспропенил1
2дезоксирибоуридин5трифосфат
ВгсШТР 5бромодезоксирибоуридин5трифосфат
Т4ТР дсзоксирибонуклеозид5трифосфат
дезоксирибонуклеозид5монофосфат
тимидин5трифосфат
4 4тиотимидин5трифосфат
5дезоксирибозофосфат
Р ДНКполимераза р
а ДНКполимераза апраймаза
5 ДНКполимераза
е ДНКполимераза е
репликативный белок А человека
репликативный белок С человека
1 флэпэндонуклеаза
ядерный антиген пролиферирующих клеток АРЕ 1 апуриноваяапиримидиновая эндонуклеаза 1 урацилДНКгликозилаза 1 полиАОРрибозополимераза
ОТ ВИЧ обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека
7еро1 ДНКполимераза из экстремально термофильной бактерии i В
пиридоксаль 5фосфат
эксцизионная репарация основания
ВВЕДЕНИЕ


Метод основан на введении в молекулу лиганда реакционноспособной группы, не влияющей драматическим образом на специфическое узнавание и связывание их ферментом. Этот подход предполагает образование специфического комплекса аналога лиганда с биополимером с последующим ковалентным присоединением аналога лиганда к аминокислотным остаткам, формирующим активный центр или находящимся в непосредственной близости от него. Эффективность этого подхода проявляется в наибольшей степени при изучении сложных многосубстратных ферментов и надмолекулярных структур. Для успешного применения аффинной модификации в изучении многокомпонентных систем в том числе для идентификации определенных белков в клеточных и ядерных экстрактах необходимо повышение селективности и эффективности данного метода. Одним из путей решения этой задачи является фотосенсибилиэированная модификация, основанная на использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов. Особый интерес представляет создание и применение новых реагентов для повышения селективности и эффективности модификации ДНКполимераз и других белков, взаимодействующих с фотореакционноспособными интермедиатами репликации и репарации ДНК, в многокомпонентных системах, таких как клеточные и ядерные экстракты. Усовершенствование этого подхода, безусловно, актуально для получения достаточных количеств меченых белков с целью их последующей идентификации. Целью данной работы являлось совершенствование метода высокоселективной и эффективной модификации ДНКполимераз, основанного на использовании фотохимической сенсибилизации, в реконструированных системах на примере ДНКполимеразы р, ДНКполимеразы из i В и ДНКполимеразы апраймазы в присутствии факторов репликации ДНК, а также идентификации ДНКполимераз этим методом в клеточных и ядерных экстрактах. ДНКполимераз в многокомпонентных системах, таких как ДНКполимераза апраймаза, клеточный экстракт фибробластов мыши и ядерный экстракт семенников крупного рогатого скота. ГЛАВА 1. Аффинная модификация один из распространенных подходов к анализу структуры и функции биополимеров. Эффективность его применения проявляется в наибольшей степени при изучении многосубстратных ферментов, которыми, например, являются ДНКполимеразы. Наиболее широко используется метод классической далее прямой аффинной модификции, принципиальная схема которого представлена на рис. На первой стадии исследуемый белок мишень формирует комплекс с реакционноспособным и радиоактивно меченым аналогом природного лиганда реагент рис. А. В результате аффинная часть реагента локализуется в связывающем центре белка рис. Б. Химическая реакция активной группы приводит к образованию ковалентной связи между остатком реагента и частью белкамишени в непосредственной близости от связывающего центра, таким образом, эта часть становится радиоактивно меченой рис. В. На следующей стадии белок расщепляется до более мелких фрагментов субъединиц, пептидов или аминокислот и меченый фрагмент идентифицируется рис. Г. На основе полученных данных делается вывод о структурной иили функциональной роли данного фрагмента белка. Первые работы по исследованию ДНКполимераз с помощью метода аффинной модификации носили качественный характер. В некоторых случаях химически активные соединения, обладая только структурными элементами субстратов, модифицируют ферменты в соответствии с критериями аффинной модификации. Например, для идентификации связывающих участков комплекса ДНКполимеразы апраймазы из i был использован интересный подход, основанный на аффинной модификации фермента с помощью пиридоксаль5фосфата 1. ДНКполимераза а представляет собой комплекс из четырех субъединиц большой каталитической субъединицы р 0, обладающей ДНКполимеразаной активностью, субъединицы кДа р и двух малых субъединиц рр, обладающих праймазной активностью. Ро а в комплексе с расплетенной ДНК выполняет две функции синтез РНКДНКзатравок на лидирующей цепи ДНК и параллельный синтез коротких РНКДНКпраймеров предшественников фрагментов Оказаки на отстающей цепи. Пиридоксаль5фоефат.