Функциональные полимерные системы для высокочувствительного анализа белков

• Автор: Робер, Марина Юрьевна
• Шифр специальности: 02.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 149 с. : ил.

1. Обзор литературы.

1.1. Макропористые монолитные носители на основе синтетических полимеров

1.1.1. Общие представления о твердых макропористых

полимерных носителях.

1.1.2. Получение макропористых монолитных полимерных носителей.

1.1.2.1. Механизм формирования поровой структуры в процессе микрофазового разделения

1.1.2.2. Особенности получения макропористых полимерных

носителей в блоке.

1.1.2.3. Порообразующие агенты

1.1.2.4. Мономеры и сшивающие агенты

1.1.2.5. Побочные реакции циклизации и образования

внутримолекулярных сшивок.
1.1.3. Методы исследования морфологической структуры
макропористых монолитов
1.1.4. Химия поверхности полимерных носителей монолитного типа.
1.2. Способы создания носителей для твердофазного биологического анализа
1.2.1. Способы модификации поверхности носителя биоаффинными
зондами лигандами
1.2.1.1. Нековалентная иммобилизация
1.2.1.2. Ковалентная иммобилизация
1.2.1.3. Ориентационная иммобилизация.
1.2.1.4. Применение подходов твердофазного пептидного синтеза.
1.ЗМикроаналитические системы для анализа белков
1.3.1. Основные принципы микроанализа
1.3.2. Общие представления о материалах, используемых для
создания операционных слоев микрочипов.
1.3.2Л. Двумерные носители.
1.3.2.2. Трехмерные 3 О носители
1.3.3. Методы детектирования целевого компонента в исследуемом образце
1.3.3.1. Радиоизотопный анализ.
1.3.3.2. Ферментный анализ.
1.3.3.3. Флуоресцентный анализ.
2. Экспериментальная часть.
2.1. Материалы.
2.2. Оборудование
2.3. Методы
2.3.1. Синтез сополимеров ГМАЭДМА, ГФИАКГМАЭДМА
и ЦЭМАЭДМА
2.3.1.1. Получение Ыгидроксифталимидного эфира акриловой кислоты
2.3.1.2. Осуществление процесса свободнорадикальной полимеризации.
2.3.2. Изучение закономерностей иммобилизации аффинною лиганда на поверхности сополимера ГФИАКГМАЭДМА и сополимера ЦЭМАЭДМА с использованием БСА в качестве модельного белка
2.3.2.1. Процедура иммобилизации.
2.3.2.2. Аналитические методы определения концентрации белка.
2.3.2.3. Анализ растворимых продуктов реакции
2.3.3. Создание микроаналитических слайдов платформы биочипа на основе полимерной монолитной матрицы и стеклянной поддерживающей среды.
2.3.3.1. Обработка поверхности стекла кислотное травление
и силаиизация.
2.3.3.2. Получение монолитных полимерных слоев в
подготовленных ячейках слайдов.
2.3.4. Биологический анализ с использованием полученных
прототипов биочипа
2.3.4.1. Тестирование микроаналитических систем с использованием модельной биокомплементарной системы мышиный антитела против мышиного
2.3.4.2. Микроанализ на поверхности стеклянного 2й биочипа.
2.3.4.1.Создание тестсистем для диагностики сифилиса
па основе сополгшера ГМАЭДМА.
2.3.4.4. Определение остеопонтина в клеточном супернатанте
3. Результаты и обсуждение
3.1. Синтез и исследование свойств сополимеров ГМАЭДМА,
ГФИАКГМАЭДМА и ЦЭМАЭДМА
3.1.1 Зависимость поровых характеристик сополимеров ГМАЭДМА, ГФИАКГМАЭДМА и ЦЭМАЭДМА
от природы используемых порогенных растворителей.
3.2. Исследование закономерностей иммобилизации белка на поверхности макропористых монолитных носителей на основе синтезированных сополимеров.
3.2.1. Оптимизация условий иммобилизации модельного белка
на поверхности сополимера ГФИАКГМАЭДМА
3.2.2. Иммобилизация модельного белка на поверхности сополимера ЦЭМАЭДМА
3.2.2.1. Исследование продуктов реакции иммобилизации лиганда на поверхности сополгшера ЦЭМАЭДМА.
3.2.2.2. Оптгшизация условий проведения реакции иммобилизации лиганда на поверхности сополимера ЦЭМАЭДМА
3.3. Полимерные платформы биочипов на основе макропористых метакрилатных слоев
3.3.1. Изготовление платформы биочипа.
3.3.2. Биологический анализ с использованием модельной
системы мышиный антитела против мышиного .
3.3.2.1. Оптгшизация условий иммобилизации аффинного
лиганда на поверхности полгшерной матрицы й
3.3.2.2. Сравнение эффективности разработанных наноаналитических устройств на основе метакрилатных монолитов и стандартных двумерных стеклянных чипов
3.3.3. Применение разработанных аналитических устройств на основе
сополимера ГМАЭДМА для детектирования антител к антигену Т. i в сыворотке крови человека
3.3.4. Детектирование осгеопонтина в клеточном супернатанте
с использованием разработанных наноаналитических устройств.
Список литературы.
Приложение I. Структурные формулы используемых в работе мономеров.
Приложение II. Расчет доли площади поверхности внутрипорового
пространства макропористых монолитов, занимаемой лигандом.
Список сокращений
ЛСМ атомносиловая микроскопия
БСА бычий сывороточный альбумин
БЭТ метод БрунауераЭммсттаТеллера
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
ГМА глицидилмегакрилат
ГФИАК Мгидроксифталимидный эфир акриловой кислоты ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота ИРЛ интрузионная ртутная порометрия
МАГИКчип МАтрица ГельИммобилизованных Компонентов на микрочипс
ОФ ВЭЖХ обратеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматог рафия
ПЭГ пол иэтил е н г л и кол ь
РНК рибонуклеиновая кислота
СЭМ сканирующая электронная микроскопия
ТСХ тонкослойная хроматография
ТФПС твердофазный пептидный синтез
ФСБ фосфатносолевой буфер
ЦЭМА 2цианоэ гил метакрилат
ЧСА человеческий сывороточный альбумин
ЭДМА этилен гл и кол ьди метакрилат
ЭХ эксклюзионная хроматография
Гтос 9флуоренилметилоксикарбонил иммуноглобулин О НУОС ни гровератрилоксикарбонил
ВВЕДЕНИЕ


Однако существенным недостатком данного носителя является длительность процесса иммобилизации белка с участием оксирановых циклов и недостаточно высокая аффинная емкость носителя. Целью настоящей работы являлась разработка принципов создания полимерных микроаналитических платформ, включающих полимерные слои монолитного типа, содержащие реакционноспособные функциональные группы и обладающие поровыми характеристиками, удовлетворяющими условиям проведения анализа в статических условиях, а именно, обеспечивающими свободное и достаточно быстрое проникновение макромолекул белка или более крупных объекгов, например, вирусов внутрь порового пространства, а также высокую адсорбционную емкость носителя. Объектами представленного исследования являлись синтетические сополимеры на основе метакрилатных и акрилатных мономеров, несущие на своей поверхности функциональные группы, способные взаимодействовать с аминогруппой молекулы белка. Впервые осуществлен синтез двух макропористых материалов на основе сополимеров Ыгидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата, а также 2цианоэтилмстакрилата и этиленгликольдимстакрилата. Разработан принцип конструирования полимерсодержащих платформ, составляющих функциональную основу биочипа, включающий изготовление на поверхности стекла операционных ячеек, силанизацию полученных ячеек и осуществление фотоинициируемой полимеризации непосредственно в изготовленных ячейках. Впервые показана возможность высокочувствительного детектирования белка в формате биочипов с использованием макропористых монолитных полимерных носителей. Практическая значимость работы. Разработаны методы синтеза макропористых полимерных материалов монолитного тина, обладающих функциональными группами и воспроизводимой поровой структурой, пригодной для использования в конструкции биочипа, предназначенного для биологического микроанализа. Разработаны и апробированы методы определения пикомолярных количеств маркерного белка остеопоитина в клеточном супернатанте при тканевоинженерном производстве костной ткани, а также антител против антигена . Макропористые носители на основе синтезированных полимеров являются перспективными материалами для осуществления анализа белка в микроформате. Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены в виде устных и стендовых сообщений на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах СанктПетербургская конференция молодых ученых Современные проблемы науки о полимерах СанктПетербург, Россия, , , Ii i ii i СанктПетербург, Россия, , i Порторож, Словения, , Ii i i I. Нюрнберг, Германия, i i Друскининкай, Литва и Отепа, Эстония. Публикации. По материалам диссертации опубликовано восемнадцать печатных работ, включая две статьи в журналах Журнал Прикладной Химии и i i, две статьи в трудах международных конференций 3, Ii i i и Измерительные и информационные технологии в охране здоровья. Мстромед , а также тезисов устных и стендовых докладов. Результаты работы также обсуждались па научнопрактическом семинаре в Институте Технической Химии Университета Ганновера Ганновер, Германия, . Вклад автора состоял в осуществлении всех представленных в работе экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций и докладов. Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Обсуждения результатов, Выводов и Списка использованной литеразуры. Материалы диссертации изложены на 8 страницах, проиллюстрированы таблицами и рисунками, список цитируемой литературы включает 5 источников. Данная работа выполнюсь в соответствии с планом НИР ИВС II по теме Создание материалов биомедицинского назначения на основе синтетических и природных полимеров, а также в рамках научной кооперации между Институтом высокомолекулярных соединений РАН и Институтом технической химии Университета Ганновера Германия грант КА и стипендия немецкого академического общества по международному обмену 5 А1, при участии Военномедицинской академии им. С. М. Кирова и технической поддержке фирмы I i Любляна, Словения.