Взаимодействие полиалкиленоксидов с компонентами клеточных мембран

• Автор: Жирнов, Артём Евгеньевич
• Шифр специальности: 02.00.06, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 153 с. : ил.

Содержание
Введение

1. Обзор литературы.

1.1. Блоксополимеры этиленоксида и пропиленоксида

1.1.1. Номенклатура.

1.1.2. Физикохимические свойства.

1.1.3. Аналитическое определение плюроников в присутствии липидов

1.2. Биологические мембраны

1.2.1. Структура биологических мембран.

1.2.2. Свойства липидного бислоя.

1.2.3. Микровязкость бислоя и способы е измерения.

1.2.4. Липидный состав биологических мембран.
1.2.5. Проницаемость липидных мембран
1.2.6. Модельные системы, используемые для исследования проницаемости мембран
1.3. Взаимодействие плюроников с компонентами биологических мембран.
1.3.1. Взаимодействие плюроников с белками.
1.3.2. Взаимодействие плюроников с липидными структурами.
1.3.2.1. Связывание плюроников с бислойными мембранами и их локализация в бислое.
1.3.2.2. Влияние плюроников на проницаемость липидных мембран
1.4. Применение плюроников в медицинских целях.
1.5. Множественная лекарственная устойчивость опухолей и влияние на не плюроников.
1.6. Использование фотоактивируемых групп для исследования локализации веществ в клетке.
2. Постановка задачи.
3. Экспериментальная часть.
3.1. Материалы.
3.2. Методы
3.2.1. Анализ полимеров
3.2.2. Введение аминогруппы в двублочный сополимер .
3.2.3. Получение 2, меченного тритием
3.2.4. Модификация 2 флуоресцентной и фотоактивируемой группой
3.2.5. Определение коэффициента распределения сополимеров между гексаном и водой.
3.2.6. Приготовление липосом.
3.2.7. Определение микровязкости мембраны липосом
3.2.8. Связывание сополимеров с липосомами.
3.2.9. Транспорт доксорубицина в липосомы с градиентом
3.2 Проникновение сополимера внутрь липосом
3.2 Культивирование клеток и анализ цитотоксичности доксорубицина и сополимеров
3.2 Связывание 32 с клетками.
3.2 Проникновение внутрь клеток
3.2 Анализ взаимодействия с клетками методом конфокальной микроскопии.
3.2 Взаимодействие клеток с , содержавшим фотоактивируемую метку
4. Результаты и их обсуждение
4.1. Свойства двублочного сополимера .
4.2. Взаимодействие блоксополимеров с клетками
4.2.1. Связывание с клетками разного типа
4.2.2. Локализация при связывании с клетками.
4.2.3. Идентификация партнров полиалкиленоксидов в мембране
4.3. Взаимодействие блоксополимеров с липосомами.
4.3.1. Взаимодействие дву и трхблочного сополимеров с липосомами из яичного лецитина
4.3.2. Влияние состава липидного бислоя на взаимодействие полиалкиленоксидов с липосомами.
5. Заключение.
6. Выводы.
Список сокращений.
Список литературы


Среди достоинств МТАТ следует выделить следующие универсальность метод применим для любых веществ, имеющих в составе углеводородные группы и циклы, в том числе и гетероциклы с необменным водородом отсутствие изменения структуры и свойств молекул при замещении протия на тритий возможность введения метки в сложные биологические макромолекулы с сохранением их биологической активности простота техники выполнения эксперимента экономичность использование небольшого количества трития экспрессность возможность широко варьировать условия проведения эксперимента. Вместе с тем при получении меченых веществ с помощью МТАТ необходимо учитывать такие особенности метода, как отсутствие селективности введения метки при получении меченого материнского соединения, невысокие выходы меченого материнского соединения изза того, что метка вводится преимущественно в тонкий поверхностный слой мишени при проведении реакции в неоптимальных условиях возможно образование большого количества радиоактивных побочных продуктов. Таким образом, использование метода термической активации трития позволяет просто и достаточно эффективно получать меченые полимеры для количественной оценки их взаимодействия с клетками и модельными липидными системами. Структура биологических мембран Одним из отличительных признаков живого организма является его обособленность, то есть наличие некоторой структуры, отделяющей внутреннюю среду от внешней. Вместе с тем организм должен обмениваться с внешней средой необходимыми веществами и энергией. Такой универсальной для всех живых организмов структурой является мембрана. В клетках эукариот мембрана не только отделяет внутреннее содержимое от внешней среды, регулируя обмен. Е роль гораздо важнее. В процессе эволюции происходило усложнение внутриклеточных структур, формирование органелл клеток в клетке, окруженных собственной мембраной ядра, митохондрий, эндоплазматичсского ретикулума, аппарата Гольджи, лизосом, эндосом. Избирательный барьер, создаваемый мембранами органелл, играет важную роль во внутриклеточных процессах обмена веществ и энергии . Биологическая мембрана представляет собой сложный белковолииидный комплекс. Согласно современным представлениям модель НиколсонаСингера жидкостномозаичной мембраны , мембрана состоит из текучего фосфолипидного бислоя и погружнных в него свободно диффундирующих белков. Гидрофобные части молекул липидов выделяются в отдельную фазу, гидрофильные обращены во внешнюю либо во внутреннюю среду клетки. Структура мембраны стабилизирована гидрофобными взаимодействиями. Существенным фундаментальным дополнением к представлениям о структуре биологических мембран послужили работы последних лет, в которых проводилось наблюдение за диффузией единичных липидных молекул. В этих работах были использованы методы, основанные на комбинации оптической и флуоресцентной микроскопии с компьютерным анализом изображения. В том случае, когда временное разрешение анализирующей изображение аппаратуры позволяет следить за эволюцией системы в микросекундном диапазоне, удается выявить, что биологические мембраны не однородны, а разделены на латеральные домены . Броуновское движение липидной молекулы внутри каждого такой области происходит в течение нескольких иногда нескольких десятков миллисекунд, после чего липид перескакивает в другую. Размеры доменов и вероятности такого перескока для молекулы липида, находящейся на границе домена, были определены в работе МигаБе с соавторами с использованием 8 различных типов клеток. Оказалось, что диаметры областей изменяются в пределах от до 0 нм, а вероятность пересечения границы домена для молекулы, подошедшей к такой границе, варьирует от 0,3 у нормальных почечных фибробластов крысы до 0,9 в клетках рака яичника китайского хомячка, трансфецированных геном рецептора В1 Бсфрагмента углобулинов линия СНОВ1. Предполагается, что неоднородность биологических мембран определяется латеральной организацией белков, фосфолипидов и холестерина, причм в некоторых случаях могут существовать области, в которые диффундирующая молекула вообще не входит.