Влияние органических растворителей на связывание профлавина и каталитическую активность бычьего панкреатического α-химотрипсина

• Автор: Мухаметзянов, Тимур Анварович
• Шифр специальности: 02.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 177 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Каталитическая активность ферментов в неводных средах

1.2. Влияние содержания воды в системе водаорганический

РАСТВОРИТЕЛЬ НА КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ

1.3. Влияние природы органического растворителя на свойства

ФЕРМЕНТОВ

1.4. Селективность и специфичность белков

В ОРГАНИЧЕСКИХ СРЕДАХ

1.5. Влияние способа приготовления белкового препарата на его
свойства.
1.6 Стабильность ферментов в органических средах
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..
2.1. Постановка задачи, выбор объектов исследования
2.2. Реактивы и материалы.
2.3. УФСГГЕКТРОФОТОМБТРИЧЕСКИЙ ЭКСПЕРИМЕНТ
2.4. Изучение каталитической активности фермента.
2.5. Обработка кинетических кривых.
2.6. Активность воды в органических средах.,.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Влияние протоноакцепторных органических растворителей на каталитическую активность
3.2. Влияние органических рас твори телей на связывание
ПРОФЛАВИНА
3.2.1. Спектры профлавина в воде и органических растворителях.
3.2.2. Связывание профлавина ахимотрипсином в воде
3.2.3. Связывание профлавина ахимотрипсином в смесях воды с органическими растворителями.
3.3. Сопоставление физикохимических параметров
ПРОТОНОАКЦЕПТОРНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ И ВОЗДЕЙСТВИЯ ВОДНООРГАНИЧЕСКИХ СМЕСЕЙ НА СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА
3.4. Влияние спиртов на каталитическую активность химотрипсина
3.5. Влияние гидрофобных растворителей на каталитическую активность химотрипсина.
3.6. Интегральный анализ кинетики ферментативных реакций в случае протекания процессов денатурацииренатурации.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


ДМСО и формамиде каталитическая активность липаз подавлена. Так, липаза из поджелудочной железы свиньи проявляет в эфирах практически такую же каталитическую активность как в алканах, в то время как каталитическая активность липазы из дрожжей в этиловом эфире более чем на порядок ниже, чем в гексане. Эффект ускорения реакции переэтерификации в гексане имеет тот же порядок, что и для реакции гидролиза в воде Табл. В данном случае эффект ускорения равен отношению скоростей катализируемой липазой переэтерификации и той же реакции в отсутствие фермента аналогично для реакции гидролиза. Из поджелудочной железы свиньи 1. Из дрожжей 2. Из плесени 1. Большую важность имеет вопрос о механизме ферментативной реакции. В той же работе установлено, что изученные реакции хорошо описываются моделью МихаэлисаМентен рис. Кроме того, авторы обнаружили, что липазы, инактивированные специфическим реагентом диэтил лнитрофенил фосфатом, не способны катализировать химические реакции в органических растворителях и, таким образом, каталитическая функция фермента в органических растворителях, как и в воде, связана с состоянием активного центра. О си о со 4 2 а. Рис. Зависимости начальной скорости переэтерификации от концентрации грибутирина А и гептанола В в системе в координатах ЛайнуивераБерка. На рис. А набор параллельных прямых получен при различной концентрации гептанола, 4. Кроме того, в работе 4 показано, что липаза из поджелудочной железы свиньи в органических растворителях может катализировать также реакции этерификации, аминолиза, обмена ацильного остатка, тиопсреэтерификации, оксимолиза. Наличие каталитической активности у липаз в органических средах может показаться тривиальным фактом, поскольку липазы существенно отличаются от других ферментов тем, что катализируют реакции с нерастворимыми или малорастворимыми в воде субстратами, кроме того, липазы функционируют на поверхности липидных мембран, то есть в водноорганическом окружении . Однако каталитическая активность ферментов в органических растворителях является фундаментальным свойством, присущим различным классам ферментов. В частности, ссриновые протеазы, как и липазы, также способны катализировать химические реакции в органических средах. В работе 5 изучена каталитическая активность двух сериновых протеаз субтилизина Карлсберга и бычьего панкреатического ахимотрипсина, в различных растворителях. Так, в случае пропанолиза этилового эфира МацетилЬфенилаланина, катализируемой ахимотрипсином, величина скорости имеет следующие значения в различных растворителях Таблица 3 из 5. Растворители расположены в таблице порядке уменьшения гидрофобности, в качестве меры которой принимали логарифм коэффициента распределения водаоктанол1 1оР. Чувствительность ферментов к действию органического растворителя различна, было обнаружено, что каталитическая активность химотрипсина меняется в разных растворителях более сильно, чем у субтилизина Карлсберга. Авторами работы 5 проведено также титрование доступных активных центров фермента в октане, у обоих ферментов доля доступных активных центров, по сравнению с водным раствором, составляет . Влияние природы органического растворителя на ферментативную активность. Описанные свойства позволяют применять гидролитические ферменты в органических растворителях для синтеза широкого спектра продуктов. Благодаря боле широкой субстратной селективности, липазы находят более широкое применение в разделении широкого спектра оптически активных соединений 9. Большой синтетический потенциал имеют ферменты класса оксидаз. Эти ферменты также демонстрируют каталитическую активность в органических средах . В органических растворителях оксидазы сохраняют свою энантиоселективность, в частности, в работе показано, что алкогольдегидрогеназа из ТкеппоапаегоЬаМег Ьгоки катализирует реакцию восстановления 2пентаноиа до 2пентанола в водноорганических средах, причем основным продуктом является И. Содержание смешивающихся с водой растворителей метанола, этанола и ацетонитрила достигало об.